植物病原菌的分离培养
植物病原菌分离方法
病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。
二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。
（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。
（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。
2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。
四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。
2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。
山田胶锈菌分离方法
山田胶锈菌分离方法
山田胶锈菌是一种重要的植物病原菌，对林业和农业生产具有一定的危害。
为了更好地研究这种病菌，掌握其特性，本文将详细介绍山田胶锈菌的分离方法。
一、材料与工具
1.培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、麦芽汁琼脂培养基等；
2.试剂：无菌水、75%酒精、氯化钠溶液（0.85%）等；
3.工具：无菌手术剪、镊子、接种针、移液器、无菌培养皿、封口膜等。
二、山田胶锈菌分离方法
1.样品采集：在发病植物的组织上采集病斑，如叶子、茎干等。
采集时注意使用无菌工具，避免交叉污染。
2.表面消毒：将采集到的病斑放入含有75%酒精的烧杯中，浸泡1-2分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，以去除表面的杂质和细菌。
3.分离：将消毒后的病斑置于无菌培养皿中，用无菌手术剪剪取病健交界处的小块组织，大小约为0.5cm×0.5cm。
4.接种：将剪取的组织块置于预先准备好的培养基上，用无菌接种针轻轻按压，使组织块与培养基充分接触。
5.培养：将接种后的培养皿放入恒温培养箱中，温度设置为20-25℃，相对湿度为60%-80%。
定期观察菌丝生长情况。
6.纯化：待菌丝生长良好后，选择生长速度较快、形态特征明显的菌落进行纯化。
用无菌接种针挑取菌丝，接种到新的培养基上，重复培养至得到纯
种。
三、注意事项
1.在分离过程中，要严格遵循无菌操作原则，避免杂菌污染；
2.选择合适的培养基，以提高山田胶锈菌的生长速度和菌落特征；
3.分离过程中要注意观察菌丝的生长情况，及时进行纯化；
4.培养条件要适宜，以保证山田胶锈菌的正常生长。
植物病理学中的病原鉴定方法
植物病理学中的病原鉴定方法植物病原鉴定是植物病理学中的一项重要研究内容。
针对植物受到的病害，科学家们致力于确定引起病害的病原微生物。
病原鉴定方法的准确性和可靠性对于病害的防治和管理具有重要意义。
本文将介绍几种常用的植物病原鉴定方法。
一、病原菌分离与筛选病原菌的分离与筛选是病原鉴定的首要步骤。
通过对受感染的植物组织进行分离培养，可以得到纯种的病原菌。
常用的方法包括采样、处理、分离和培养等。
从植物组织样品中采集病原菌，经过适当的处理后，将其分离在含有适宜培养条件的培养基上进行培养。
同时，还可以通过形态学和生理学特征对病原菌进行初步筛选，以鉴定可能的病原菌。
二、遗传学分析遗传学分析是病原鉴定的重要手段之一。
通过对病原菌的遗传信息进行分析和比对，可以确定其在系统发育中的位置以及与其他相关菌株的关系。
常用的遗传学分析方法包括PCR技术、DNA测序、RFLP 等。
PCR技术可以扩增特定基因片段以及鉴定病原菌与寄主植物之间的亲缘关系。
测序技术可以获取病原菌基因组的完整序列信息。
RFLP （限制性片段长度多态性）方法则通过识别特定的限制性内切酶切割位点来进行病原菌的鉴定。
三、免疫学分析免疫学分析是一种通过检测病原菌与植物寄主之间的免疫反应，来进行病原鉴定的方法。
常用的免疫学分析包括免疫组织化学染色、ELISA以及免疫电镜等。
免疫组织化学染色通过使用特异性抗体来标记病原菌的抗原，从而在组织中检测出病原菌的存在。
ELISA（酶联免疫吸附测定法）则通过检测特定抗原与抗体之间的反应来鉴定病原菌。
四、分子检测随着分子生物学技术的发展，分子检测方法在病原鉴定中得到了广泛应用。
分子检测方法基于病原菌特定的基因序列，通过PCR扩增和分析来进行鉴定。
常用的分子检测方法包括引物特异性PCR、实时荧光定量PCR、DNA条形码等。
引物特异性PCR方法利用特异性引物扩增特定的基因片段，以鉴定病原菌。
实时荧光定量PCR方法可对扩增结果进行实时监测，实现高灵敏度的检测。
实训8植物病害病原物的分离培养和鉴定
实训8植物病害病原物的分离培养和鉴定实训8 植物病害病原物的分离培养和鉴定1(实训目标通过对植物病原物分离培养方法的学习和实际操作，掌握病原物分离培养的基本原理和基本方法，为植物病原物的鉴定及病害的正确诊断提供依据;了解各种病原物的形态和生物学特性，为植物病害的有效防治打下基础。
2(实训材料(1)材料新采集的植物真菌、细菌、线虫病害的典型症状植株、PDA培养基、牛汁胨平板培养基等。
(2)仪器用具超净工作台、显微镜、解剖镜、恒温箱、三角瓶、灭菌培养皿、解剖剪、小镊子、移植环、酒精灯、70%酒精、95%酒精、0.1%升汞水或7%漂白粉消毒液、5%来苏尔、灭菌水、滤纸、蜡笔、标签、胶水、火柴、玻璃漏斗(直径10,15cm)、铁架台、橡皮管、弹簧夹、尖嘴玻璃管、网筛、挑针、竹针或毛针、凹穴玻片等。
3(实训内容(1)植物病原真菌的分离培养;(2)植物病原细菌的的分离培养;(3)植物病原线虫的分离培养。
4(操作步骤与方法1)植物病原真菌的分离培养对植物病原真菌通常采用的是组织分离法。
此方法的基本原理是:创造一个适合真菌生长的无菌营养环境，促使染病植物组织中的病原真菌在人工培养基上大量生长、繁殖，使其成为纯菌种，以便为病原鉴定和病害诊断提供实物依据。
(1)分离材料的选择及处理选择新鲜的典型症状植株、器官或组织，洗净，晾干，取新鲜病斑病健交界部分，切成,5mm见方小块用作分离材料。
将分离材料置于灭菌的小容器中，先用70%酒精漂洗约2,33s，迅速倒去，以避免材料表面产生气泡;然后用0.1%升汞溶液消毒1~2min(消毒时间因材料厚度不同而异;消毒剂也可根据不同情况选用漂白粉、次氯酸钠等)，再经无菌水漂洗3,4次，最后用灭菌的滤纸吸干材料上的水。
(2)工具的消毒、灭菌先打开超净工作台通风20min以上，用70%酒精擦拭手、台面和工作台出风口进行消毒;分离用的容器和镊子用95%酒精擦洗后经火焰灼烧灭菌。
分离也可在没有尘土而空气相对静止的室内进行，方法是擦净工作台，在台面上铺一块湿毛巾，地面洒水，然后在室内喷洒5%来苏尔熏蒸灭菌2~3h即可。
一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011
4．常规分离方法 •植物病原真菌的分离方法主要有两种：
组织分离法和稀释分离法。
•组织分离法是最常用的方法. •稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子 的病原真菌的分离。
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4.1 组织分离法
植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。 就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水 洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。 切取组织的大小要适宜，一般可将较大的 组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭 菌水洗过以后培养。
4、灭菌
制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。 分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干 /烘干、包装好，进行干热灭菌。 灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。 高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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4.2.1 孢子分离法
产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)
、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属
(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属
(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或
划线法分离。
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许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以
2）向装有病组织的小碟中加入70%酒精
（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉 酒精。
注:先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，
减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间 较短(一般数秒至lmin)。
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3）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠
溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间 可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。
病原物的分离培养和纯化
病原物的分离培养和纯化摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。
该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。
设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。
长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。
在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。
关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基目的意义在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。
通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。
1材料与方法1.1 试验材料1.1.1供试材料新鲜山茶树真菌病叶叶片1.1.2 试验仪器与用品真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。
1.2 试验方法1.2.1试管的制作用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。
植物病原真菌的分离培养精选文档
植物病原真菌的分离培养精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
病原物的分离与培养
病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义;分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术..一方面;在一个新的病害研究中;通过分离与培养获得病原物的纯培养;完成柯氏法则;以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环侵染、病程等等..所谓病原物的分离;即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养;即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上;从而获得其纯培养..病原物的分离与培养;需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养..－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念..灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子..消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体;在植物病理学实验中;需要进行纯培养;不能有任何杂菌污染;因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌..消毒与灭菌的方法很多;一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法..一热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类..1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的..细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关..在菌体受热时;当环境和细胞内含水量越大;则蛋白质凝固就越快;反之含水量越小;凝固越慢..因此;与湿热灭菌相比;干热灭菌所需温度高160～170℃;时间长1～2 h..但干热灭菌温度不能超过180 ℃;否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦;甚至引起燃烧..干热灭菌使用的仪器是烘箱..干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种..火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等;无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌..涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌..通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气160～170℃进行灭菌..此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌..进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤;以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板;以防包装纸烤焦起火；在升温过程中;如果红灯熄灭;绿灯亮;表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前;切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂..2 湿热灭菌1 高压蒸汽灭菌此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内;0.1MPa;121℃保持15～30 min进行灭菌..时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化;以达到彻底灭菌..这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等;也可用于玻璃器皿的灭菌..2 常压蒸汽灭菌在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法..对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌..这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行;也可用普通蒸笼进行灭菌..由于常压;其温度不超过100℃;仅能使大多数微生物被杀死;而芽孢细菌却不能在短时间内杀死;因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌;达到彻底灭菌的目的..常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内;每天加热100℃;30 min;连续3 d;第一天加热后;其中的营养体被杀死;将培养物取出放室温下18～24 h;使其中的芽孢发育成营养体;第二天再加热100℃;30 min;发育的营养体又被杀死;但可能仍留有芽孢;故再重复一次;使彻底灭菌..二过滤除菌许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法;—均会被热破坏;因此采用过滤除菌的方法..应用最广泛的过滤器有：1 蔡氏过滤器该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属银或铝漏斗组成;分上、下两节..过滤时;用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间;然后将溶液置于滤器中抽滤..每次过滤必须用一张新滤板..根据其孔径大小;滤板分为3种型号：K型最大;作一般澄清用；EK滤孔较小;用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小;可阻止大病毒通过..使用时可根据需要选用..2 微孔滤膜过滤器这是一种新型滤器;其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜..微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成..出口处可连接针头;入口处可连接针筒..使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间;旋紧盖盒;当溶液从针筒注入滤器时;此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面;从而达到除菌的目的..根据待除菌溶液量的多少;可选用不同大小的滤器..此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分..但由于滤量有限;所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌..实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm;但若要将病毒除掉;则需更小孔径的微孔滤膜..微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：①组装、灭菌将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中;旋紧..压平;包装灭菌后待用0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min..连接..将灭菌滤器的入口在无菌条件下;以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上;将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中..②压滤将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中..滤毕;将针头拨出..压滤时;用力要适当;不可太猛太快;以免细菌被挤压通过滤膜..提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染;过滤时应避免各连接处出现渗透现象..三辐射灭菌紫外线灭菌是用紫外线灯进行的..波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力;其中以260 nm的杀菌力最强..在波长一定的条件下;紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比..紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联;从而抑制了DNA的复制..另一方面;由于辐射能使空气中的氧电离成O;再使O2氧化生成臭氧O3;或使水氧化生成过氧化氢H2O2..O3和H2O2有杀菌作用..紫外线穿透力不大;所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌..注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用;对皮肤有刺激作用;故不能直视紫外线灯光;更不能在紫外线灯光下工作..紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜..此外;采用60Co-γ射线灭菌;也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜;各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌..γ射线灭菌的最大优点是穿透力强;可在厚包装完好条件下灭菌..四化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法..能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂;如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能;使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂;如磺胺类及大多数抗生素等..化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关..植物病理学实验室中常用的化学药品有2％煤酚皂溶液来苏尔、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等..消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术;而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值..根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法..附: 高压灭菌1、目的要求学习灭菌与消毒的基本原理及应用范围;学习高压蒸汽灭菌的操作方法..2、基本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内;通过加热;使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽..待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽后关闭排气阀;继续加热;此时由于蒸汽不能溢出;而增加了灭菌器内的压力;从而使沸点增高;得到高于100℃的温度;导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的..在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时;锅内冷空气的排除是否完全极为重要..因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压;所以;当水蒸气中含有空气时;在同一压力下;含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度..灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变..例如含糖培养基用0.06 MPa、112℃灭菌15 min;但为了保证效果;可将其他成分先行121℃灭菌20 min;然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液..又如盛于试管内的培养基以0.1MPa;121℃灭菌20 min；即可;而盛于大瓶内的培养基最好以0.1MPa、122℃灭菌30 min..实验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式和手提式两种..其结构和工作原理相同;本实验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例;介绍其使用方法..全自动高压蒸汽灭菌锅在设定好有关的参数后;加温、放气、灭菌、干燥可一次完成;使用方法可参照厂家说明书..3、材料、试剂与仪器材料马铃薯葡萄糖培养基PDA..仪器与用具培养皿、手提式高压蒸汽灭菌锅、可调式电炉等..4、操作步骤1 首先将内层锅取出;向外层锅内加入适量的水;使水面与三角搁架相平为宜..提示：切勿忘记加水;同时加水量不可过少;以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故..2 放回内层锅;并装入待灭菌物品..提示：注意不要装得太挤;以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果..三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触;以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞..3 加盖并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内..再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓;使螺栓松紧一致;勿使漏气..4 用电炉加热并同时打开排气阀;使水沸腾以排除锅内的冷空气..待冷空气完全排尽后;关上排气阀;让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升..当锅内压力升到所需压力时;调节电炉控温旋钮;维持压力至所需时间..本实验用0.1Mpa l21.5℃;20 min灭菌..提示：灭菌的主要因素是温度而不是压力..因此;锅内冷空气必须完全排尽后;才能关上排气阀;维持所需压力..5 灭菌所需时间到后;切断电源;让灭菌锅内温度自然下降;当压力表的压力降至“0”后;打开排气阀;旋松螺栓;打开盖子;取出灭菌物品..提示:压力一定要降到“0”后;才能打开排气阀开盖取物..否则会因锅内压力突然下降;使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口;造成棉塞沾染培养基而发生污染..6 将取出的灭菌培养基放入25℃温箱培养48 h;经检查若无杂菌生长;即可待用..二、培养基的制作1、目的要求了解培养基的配制原理;掌握培养基的制备方法..2、基本原理在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基..培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养;用人工方法配制而成的营养基质..其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等..微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好;因此;对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围..－般而言;真菌调节到微酸;细菌调节到微碱..培养基的种类很多;不同的微生物所需要的培养基不同..依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种..固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %～2 %的琼脂;半固体培养基是加入0.2 %～0.5 %的琼脂..琼脂agar 起凝固作用;一般微生物均不能分解利用..根据营养物质来源的不同;培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类..天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成;如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等..半合成培养基中既有一些天然的有机物质;又有一些成分简单或明确的化合物..如常用的马铃薯葡萄糖培养基PDA、肉汁胨培养基NA等..合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的;无任何成分不明确的物质;常用于研究微生物的生理生化性状;如查氏Czapek培养基等..根据培养基用途不同;可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等..在植物病理学研究中;最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基;主要用于分离培养病原真菌..在培养基配制完之后;必须经过灭菌;以便彻底杀死其中原有的一切微生物..3、材料、试剂与仪器材料马铃薯..试剂葡萄糖、琼脂等..仪器与用品高压蒸汽灭菌锅、pH试纸或酸度计、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等..4、操作步骤PDA培养基马铃薯葡萄糖培养基马铃薯去皮200 g 、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml ;自然pH..在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖;这样配制的培养基也称为PSA培养基..1 称量称量去皮马铃薯200 g;葡萄糖20 g;琼脂15～20 g..提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量;质量好的15 g就够了;质量差的应适当增加..另外;在夏天气温较高时;适当增加用量..2 将马铃薯切成小块;放入锅中;加水1000 ml;煮沸30 min..用纱布滤去马铃薯残渣..3 将马铃薯滤液放回锅中;加入琼脂;加热熔化..提示：在琼脂熔化的过程中;需要用玻璃棒不断搅拌;并控制火力不要使培养基溢出或烧焦..4 加入葡萄糖葡萄糖溶解后;加入适量的水以补充加热过程中损失的水分;定容至1000 ml..提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度;如1 000 ml、2000 ml等;在定容时直接将水加至已标记的刻度即可..5 分装根据不同的实验目的;可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内..分装试管;其量为管高的1／5;灭菌后制成斜面..分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜..6 加塞在管口或瓶口塞上棉塞..棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花;棉塞可过滤空气;防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发;故在植物病理学研究工作中普遍使用..正确的棉塞是形状、划、、松紧与管口或瓶口完全适合;过紧时妨碍空气流通;操作不便；过松则达不到滤菌的目的;且棉塞过小往往容易掉进试管内..正确的棉塞头较大;约有1／3在外;2／3在试管内..分装过程中注意不要使培养基沾染在管瓶口上以免浸湿棉塞;引起污染..7 包扎加塞后;将试管用线绳捆好;再在棉塞外包一层牛皮纸;以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞;其外再用一道线绳扎好..用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等..8 灭菌将上述培养基以0.1MPa;121℃;高压蒸气灭菌20 min..9 搁置斜面将灭菌的试管培养基竖置冷至50℃左右以防斜面上冷凝水太多;将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上;搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜..培养基经灭菌后;必须放在37℃温箱培养24h;无菌生长者方可使用..PDA培养基一般不需要调pH..对于要调节pH的培养基;一般用pH试纸测定其pH..如果培养基偏酸或偏碱时;可用l mol／L NaOH 或l mol／L HCl溶液进行调节..调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液;防止局部过酸或过碱破坏培养基成分..5、流程图培养基配制高压灭菌培养观察三、病原菌的分离培养和纯化1、目的要求1 了解分离与纯化微生物的基本原理及方法..2 掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术..3 掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法..2、基本方法植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种..最常用的方法是组织分离法;而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离..病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用;在有些情况下也采用稀释分离法..为了获得分离菌的纯培养;必须要进行分离菌的纯化;纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法..3、材料、仪器与用具3.1 材料1 稻瘟病叶、病节、病穗颈Pyricularia oryzae..2 柑桔炭疽病Colletotrichum gloeosporioides..3 黄瓜灰霉病Botrytis cineria..4 番茄灰霉病果Botrytis cinerea..5 黄瓜菌核病果Sclerotinia sclerotiorum..6 黄瓜细菌性角斑病叶Pseudomonas syringaepv．1achryrnans ..7 水稻白叶枯病叶Xanthomonas campestris pv．oryzae ..8 白菜软腐病叶Erwinia carotovora subspp．carotovora..3.2．培养基PDA培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等..3.3．仪器与用品超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲针、接种环铒、70％酒精、0.1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等..4、实验操作一病原真菌的分离1．组织分离法其步骤为：1 取灭菌培养皿一个;置于湿纱布上;在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名..提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手;操作时还需用70 ％酒精擦拭双手；无菌操作时;呼吸要轻;不要说话..2 用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1～2滴可减少细菌污染;然后将融化而冷至60℃左右的PDA培养基倒人培养皿中;每皿倒10～15 ml;轻轻摇动使之成平面..凝固后即成平板培养基..提示：加入25％乳酸1～2滴;可减少平板上出现污染细菌菌落..除乳酸外;在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长;也是常用的方法..加青霉素20μg／m1可以抑制G+ 细菌生长；加多黏霉素B5.0μg／ml..可以抑制G-细菌生长；加链霉素40μg／ml或氯霉素50μg／m1可以抑制大部分细菌的生长..除了氯霉素可在灭菌前加入外;其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45℃左右以手背触三角瓶感到烫;但尚可以忍耐为宜时加入..倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领;不必在火焰上方;一般很少污染..3 取真菌叶斑病的新鲜病叶或其他分离材料;选择典型的单个病斑;用剪刀或解剖刀从病斑边缘病健交界处;切取小块每边长3～4 mm病组织数块..提示：选择新患病的组织作为分离的材料;可以减少腐生菌混入的机会..腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生;因此;一般斑点病害应在临近健组织的部分分离..4将病组织放入70％酒精中浸3～5s后;按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5 min 也可使用其他表面消毒剂;如植物组织柔嫩;则表面消毒时间宜短；反之则可长些..然后放入灭菌水中连续漂洗三次;除去残留的消毒剂..提示：先用70％的酒精浸2～3 s是为了消除寄主表面的气泡;减少表面张力;70％的酒精亦用于表面消毒;处理的时间较短一般数秒至l min升汞溶液消毒的时间因材料而异;可自30s至30min不等;一般情况下;需时间3～5 min..5 用无菌操作法将病组织移至平板培养基上;每皿内放4～6块..提示：在将病组织小块移放到平板表面之前;应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水;以大大减少病组织附近出现细菌污染..6 将培养皿倒置放入25℃左右恒温箱内培养..一般3～4 d后观察待分离菌生长结果..7 若病组织小块上均长出较为一致的菌落;则多半为要分离的病原菌..在无菌条件下;用接种针铲自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上;在25 ℃左右恒温箱内培养;数日后;观察菌落生长情况;如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种;便可置于冰箱中保存..提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外;还要在显微镜下检查;进一步确定..如果是对未知病原菌的组织分离;则要将长出的菌落分别转出;通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌..在组织分离工作中;如果植物材料体积较大且较软如患灰霉病的番茄果实;在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上;完成分离工作..2. 稀释分离法1 取灭菌培养皿三个;平放在湿纱布上;编号;并注明日期、分离材料及分离人姓名..2 用灭菌吸管吸取灭菌水;在每一皿中分别注入0.5～1.0 ml..3 用移植环蘸一滴孢子悬浮液;与第一个培养皿中的灭菌水混合;再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中;混合后再移三环到第三个培养皿中..4 将熔化并冷却到45～50℃的培养基;分别倒在三个培养皿中为防止细菌污染;也可以向每个培养皿中事先加入1～2滴25％乳酸;摇匀;凝固;要使培养基与稀释的菌液充分混匀..提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好;过热易将病原菌烫死而使分离失败;过冷则倒入培养皿中后难以形成平板;不利于分离..5 将培养皿翻转后置恒温箱25℃中培养;数日后观察菌落生长情况..6 挑菌将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取;接种到斜面培养基上;置25℃左右培养..待菌长出后;检查菌是否单纯;若有其他菌混杂;就要再一次进行分离纯化;直到获得纯培养..二病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用..在进行分离之前;首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断;即经过镜检确认有喷菌现象以后;才对该病组织作分离工作..稀释分离法是最经典的标准分离法;方法同上述真菌分离..除去上述稀释分离法以外;较为方便的是划线分离法：1 预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中;凝成平板后;翻转放在30℃恒温箱中2～4 h;使表面无水滴凝结..也可凝成平板后直接使用..2 将病组织先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min;再用无菌水换洗3次后;放在灭菌培养皿中的灭菌水中;用灭菌玻棒研碎;并让组织碎块在水中浸泡20～60 min;让细菌释放到灭菌水中..3 用灭菌的接种铒;接种环；蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线;尽量不要把平板表面划破..划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼;冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线..灭菌后再划第三次线..提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要;这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大..4 用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后;翻转培养皿;放在26～28℃恒温箱中培养..1～3 d后观察有无细菌生长;在哪些地方有单菌落生长出来其中的优势单菌落应为待分离菌形成的..5 仔细挑取病原菌的单菌落;并移植到斜面培养基上..同时;再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离;经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致;并与典型描述的特征相一致时;即表明已获得纯培养..最好要经过连续三次单菌落的分离;才能确保纯化..三真菌、细菌培养性状。
植物病原菌的检测原理
植物病原菌的检测原理植物病原菌的检测原理主要分为传统检测方法和分子检测方法两大类。
传统检测方法包括病斑观察、显微镜检测、分离培养、生化、免疫学和生物学检测方法等；分子检测方法主要包括PCR、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、荧光定量PCR、内参PCR、两步PCR、多重PCR、血清学检测、微阵列分析、测序等。
下面将详细介绍传统检测和分子检测方法的原理和应用。
传统检测方法1. 病斑观察法病斑观察是一种最简单、最常用的检测方法。
通过观察植物叶面、茎部等组织上的病斑症状特征，如色素改变、溃疡、软腐、凋萎等症状，判断植物是否感染了病原菌。
该方法通常用于狭义上的病原菌检测，即只能推断出可能存在病原菌，但不具备进一步鉴定病原菌的能力。
2. 显微镜检测法显微镜检测是通过放大被检测样品的细菌菌落、孢子、分生孢子等微观结构，借助显微镜观察和鉴定病原菌的一种方法。
该方法通过观察病原菌的形态、大小、染色性质、分离和生长特征等，与已知的病原菌进行比对，确定植物感染的病原菌种类。
3. 分离培养法分离培养法是通过将被检测的植物组织样品分离培养于富含营养物的培养基上，利用病原菌的生长特性和营养需求进行分离纯化。
通过培养基的选择、温度、湿度、pH值、光照等条件的控制，使病原菌表现出明显的生理与形态特征，便于进一步鉴定和定量检测。
4. 生化检测法生化检测法主要是通过检测病原菌体内的一些特有的生化成分和活性，如酶活性、甘油分解酸生成、酸碱生成、氨氧化等，根据其特异性判断病原菌的类型和数量。
5. 免疫学检测法免疫学检测法主要是利用免疫学原理，通过检测样品中的病原菌抗原或抗体来判断其存在与否。
免疫学检测方法可分为免疫电镜检测、免疫荧光检测、ELISA等。
6. 生物学检测法生物学检测法是利用宿主植物对某一种病原菌的特异性反应来检测病原菌。
常用的生物学检测方法包括种子法、接种法、淫种法、耐病品种鉴定法等。
分子检测方法1. PCR检测法PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，能在短时间内通过特异引物和聚合酶对DNA模板进行扩增。
【精品】植物病原真菌的分离培养
【精品】植物病原真菌的分离培养植物病原真菌的分离培养是植物病害学研究中的常规技术，它是诊断病原微生物的重要手段。
通过环境、罹病组织或病株上的真菌分离，可以准确地确定病原物种，病害发生的原因和病害防治的策略。
本文将介绍植物病原真菌的分离培养方法及其注意事项。
一、实验材料1. 植物体、果实或病株。
2. 无菌匀质培养基：具备营养丰富，pH约为7.0，含有适量的蔗糖、氨基酸、维生素和矿物质元素。
3. 无菌器具：试管、培养皿、匀质棒、无菌酒精灯、注射器等。
二、分离方法1. 选材：选择患病植物或病株，减少环境污染的干扰，以便于真菌分离和培养。
2. 分离：在实验室中进行无菌操作，将病株或罹病组织的表皮割去，注意不要带皮层或子叶，然后用30%的酒精或75%的酒精消毒5-10秒，沥干后放入无菌盘中。
3. 培养：将培养基煮沸，冷却后加入抗生素，避免杂菌污染，用培养皿接种盘，置于26℃左右的恒温箱中孵育。
初次孵育检查时间视病原真菌的生长速度而定，通常在1-2周内可见初生菌丝和菌落。
如果没有生长或生长极为缓慢，可能需要增加孵育时间或重新分离。
4. 子培养：将孵育的菌落通过匀质棒挑选到其他含有抗生素的培养基中，进行子培养，以保证分离出的真菌种属的准确性。
如培养子菌落中有杂菌或真菌菌落与初步分离的不一致，应重新分离。
5. 稳定培养：对于经过检查并确认是病原真菌的菌株，应进行深层冻存或贮存，以免失掉纯度，同时要做好鉴定记录。
三、注意事项1. 操作要无菌，防止环境污染，避免误诊。
2. 病株样品与周围环境隔离，减少环境干扰。
3. 选用适当的培养基，保证真菌菌落的生长和营养。
4. 操作时注意安全，避免接触真菌孢子、毒素等对人体有害的物质。
5. 菌落的检查应在暗的环境下进行，以免光照影响观察结果。
四、结语植物病原真菌的分离培养是诊断和定位植物病害的一个重要工具。
通过正确的操作方法和注意事项，可以准确地分离出病原菌，并对其性质和特征进行鉴定和确认。
植物病原细菌鉴定实验指导
植物病原细菌鉴定实验指导一、实验目的了解植物病原细菌的分类与鉴定方法，掌握分离、纯化、鉴定菌种方法，培养技术和生化鉴定技术。
二、实验原理细菌的鉴定包括形态学、生理生化和分子生物学鉴定等。
一般细菌的形态学特征，如生长形态、荧光特性、大小观感、颜色、质地等特征对细菌种属的鉴定非常重要；生理生化鉴定主要通过细菌在不同培养基上的生长特性、代谢途径等指标；分子生物学鉴定主要通过PCR扩增等手段，对细菌基因组的DNA序列进行分析和比对，建立物种特异性的DNA指纹。
三、实验步骤1、样品收集和处理收集可能感染病原细菌的植物样品，如叶片、茎、根等，通常选择表现症状明显的植株或部位作为样品。
将植物样品取出，进行表面消毒处理，可使用0.1%次氯酸钠、70%乙醇等消毒液对样品进行表面消毒，去除植物表面微生物的影响。
2、分离与纯化将消毒后的植物样品移植到适宜的培养基中，如普通营养琼脂培养基，选用相应的富营养培养基有利于分离病原菌。
将培养皿放置在适宜的温度和湿度下进行培养，通常选用28℃，相对湿度为60%左右为适宜。
在植物样品污染细菌生长后，从单个菌落中分离纯化，将纯化后的菌株进行保存或进行进一步的鉴定工作。
3、形态学鉴定观察细菌菌落的形态、大小、颜色等特征，对细菌形态特征的精细观察非常重要。
如分泌物、粘质或胞外多糖的分泌，以及生物质塑性、溶胶的形成等细节观察是形态学鉴定的重要参考标准。
4、生理生化鉴定通过生理生化鉴定，了解细菌的生长特性和代谢途径，选用不同的培养基和筛选方法可以判断病原菌的代谢类型。
如选择碳水化合物代谢及活性酶的测定等手段，增加了进一步分类和鉴定细菌的能力。
5、分子生物学鉴定应用PCR技术，对从植物样品中提取到的细菌DNA进行扩增，基于特异性PCR产物筛选与目的DNA序列的核苷酸序列比对，可以非常准确地测定细菌所属属种。
四、实验注意事项1、实验室要保持清洁，保证实验环境卫生。
2、植物样品取自已知病害株，避免误判。
简述植物病原真菌组织分离法和稀释(孢子)分离法的适用材料及优缺点-概述说明以及解释
简述植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及优缺点-概述说明以及解释1.引言植物病原真菌是引起农作物疾病的主要病原体之一，研究植物病原真菌的组织分离方法和稀释（孢子）分离方法对于疾病的诊断和防治具有重要意义。
植物病原真菌组织分离法是通过从感染植物组织中分离出纯种的真菌菌落，从而研究其特性和致病机制。
稀释（孢子）分离法则是通过将真菌孢子稀释到一定浓度后分离，利用分离得到的孢子进行研究和防治。
本文将对这两种方法的适用材料、优点和缺点进行简述和总结，以期为植物病原真菌研究提供参考。
）分离法的缺点":{}}}}请编写文章1.1 概述部分的内容1.2文章结构文章结构是指文章的整体架构和组织方式，帮助读者更好地理解和掌握文章的内容。
本文主要介绍植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及其优缺点。
具体的文章结构如下：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 植物病原真菌组织分离法2.1.1 适用材料2.1.2 优点2.1.3 缺点2.2 稀释（孢子）分离法2.2.1 适用材料2.2.2 优点2.2.3 缺点3. 结论3.1 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料3.2 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的优点3.3 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的缺点在文章结构中，逐步展开对植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的介绍，包括适用材料、优点和缺点等方面的内容。
最后通过结论对两种方法进行总结和概括，使读者对这两种方法有个整体的认识。
1.3 目的本文的目的是对植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及其优缺点进行简要描述和分析。
通过介绍这两种常用的真菌分离方法，旨在帮助读者更好地了解和选择适合的实验方法，提高病原真菌的分离效率。
具体而言，我们将详细介绍植物病原真菌组织分离法的适用材料，包括所需的培养基、植物组织、分离介质等。
园林植物病原菌的分离培养
2. 臭氧或者双氧水（H2O2）
O2 hγ
2[O]
O2
oxidization来自O3胸腺嘧啶二聚体的形成及光修复示意图
➢ 注意：
1. 紫外线的穿透力较弱，只能用于物体表面的消毒。主要用于 无菌室，接种箱，手术室等的空气和物体表面消毒。
2. 紫外线对视神经及眼结膜有较大的损伤，请勿直视紫外线。 紫外线灯距离照射物距离最好不超过1.2 m。
0.1MPa，121 ℃，20～30 min。
三、仪器与材料
仪器与用具：高压蒸汽灭菌锅，培养皿 材料：马铃薯葡萄糖培养基（PDA，Potato Dextrose Agar）
四、操作步骤
高压蒸汽灭菌锅的使用
➢ 检查灭菌锅内水位（不能用自来水？） ➢ 加盖、拧紧 ➢ 加热升温 ➢ 排冷空气 ➢ 升温、保压持续升温，维持0.1MPa，20～30 min。 ➢ 降压、取物
手提式高压蒸汽灭菌锅
立式高压蒸汽锅和卧式高压蒸汽锅
大容量立式高压蒸汽锅
过滤除菌
➢ 主要适用于血清、抗生素、糖溶液等，这些物质用一般加 热消毒灭菌方法，均会被破坏，因此应采用过滤除菌的方法。
应用最广的过滤器有蔡氏过滤器和微孔滤膜过滤器。
蔡氏过滤器示意图
蔡氏过滤器分上、下两节， 过滤时，用螺旋把石棉板紧紧地夹 在上、下两节滤器之间，然后将溶 液置于滤器中抽滤，每次过滤必须 用一张新滤板。滤板根据其孔径的 大小可分为3种类型：K型最大， 用于澄清；EK型缕空较小，用来 过 滤 细 菌 ； EK-S 最 小 用 于 过 滤 病 毒。
必须等到灭菌锅内的压力为 “ 0 ” 时，方可打开灭菌锅！！
五、记录实验结果 （数据，图片） 六、分析实验结果，总结实验成败的原因 七、撰写实验报告
病原物的分离与培养
病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。
一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。
所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。
病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。
－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。
灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。
消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。
消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。
在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。
但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。
火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。
涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。
通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。
此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
植物病原真菌的分离培养
实验十三植物病原真菌的别离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的别离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中别离出来，再将别离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的别离培养。
植物病原真菌的别离一般都是采用组织别离法，就是切取小块病组织，经外表消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的别离培养是植物病理学实验最根本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌别离培养的一般原那么和方法。
三、实验材料及准备：1．别离材料：梨黑斑病〔Alternaria kikuchiana〕，柿树圆斑病〔Pestnlotia sp〕及杉木炭疽病〔Glomerella cingolata〕新发病的病叶；杨树烂皮病〔Cytospora chrysosperma〕国槐腐烂病〔Dothiorella sp.〕的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．别离用具〔每小组为单位〕酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿〔Φ9cm〕24套，小烧杯〔5ml〕4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个〔内放脱脂棉球〕0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶〔60ml〕1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：〔一〕、别离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒别离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台〔超净工作台〕上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒〔常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
假设用紫外线灯照射那么需20-30分钟〕。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，防止空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
植物病原菌分离方法
植物病原菌分离方法（综合版）植物病原细菌分离方法：分离培养基（NA）植物病原细菌的方法一般采用稀释分离法：1.取灭菌研钵加无菌水适量，切去4 mm大小病块组织，经过表面消毒和无菌水冲洗3次后放入研钵中研碎，静置10-15 min，使组织中的细菌进入水中制成悬浮液；2.配制不同稀释度的细菌悬浮液；准备3-5个灭菌培养皿，每个加200 µl无菌水；3.用灭菌移植环从第1个培养皿中移植1-2环细菌悬浮液到第2个培养皿中，充分混匀后再从第2个培养皿移植1-2环到第3个培养皿中，依次类推；4.平板划线分离，28℃培养2-3天；5.挑取单菌落划线再次纯化；菌落形态观察：1.形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘的形状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等；2.菌苔表面有光滑的、不平整的和皱褶的、易挑取、质地均匀3.菌苔颜色也不同，质地有粘质的、膜质的或蜡质的。
有透明的、半透明的或不透明的，表面有暗色或发亮的4.菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等特征注：1.若分离成功，平板上菌落形态和大小比较一致，即使出现几种不同形状的菌落，终有一种是主要的；2.如果菌落类型很多，且不分主次，很可能未分离到病原细菌，应考虑重新分离；3.如果不熟悉一种细菌菌落的性状，就应选择几种不同类型的菌落，分别培养后接种测定其致病性，最终确定病原菌；4.一种细菌病害一般由一种病原菌引起的，平板上出现几种不同类型的菌落实质上只有一种是真正的病原细菌；5.腐烂型的细菌病害即使是混合侵染的，但也有一种是主要的。
6.各种植物病原细菌生长快慢不同：假单胞菌属和欧文氏菌属1-2天土壤杆菌属细菌2-3天黄单胞菌属细菌3-4天棒杆菌属的细菌5-8天才出现明显的菌落植物病原细菌生长量测定法直接法测体积粗放的方法，将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。
称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%~20%。
植物病原真菌的分离培养
实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体,如果给予适宜的环境条件,除个别种类外,一般都能恢复生长与繁殖。
植物病原菌的分离就就是指通过人工培养,从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开,并从寄主植物中分离出来,再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化,这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都就是采用组织分离法,就就是切取小块病组织,经表面消毒与灭菌水洗过后,移到人工培养基上培养。
二、实验目的:植物病原菌的分离培养就是植物病理学实验最基本的操作技术之一,它对原害鉴定,病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都就是经常使用的研究手段。
通过本实验,要求植物病原菌分离培养的一般原则与方法。
三、实验材料及准备:1.分离材料:梨黑斑病(Alternaria kikuchiana),柿树圆斑病(Pestnlotia sp)及杉木炭疽病(Glomerella cingolata)新发病的病叶;杨树烂皮病(Cytospora chrysosperma)国槐腐烂病(Dothiorella sp、)的带有新病斑的枝条;油松种子。
2.分离用具(每小组为单位)酒精灯4个,手术剪4把,眼科镊4把,PDA培养基3瓶,培养皿(Φ9cm)24套,小烧杯(5ml)4个,大烧杯1个,斜面培养基12管,灭菌水4瓶,75%酒精瓶1个(内放脱脂棉球)0、1%升汞瓶1个,5%乳酸瓶(60ml)1个,火柴1盒,湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤:(一)、分离前的准备工作:1.工作环境的清洁与消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台(超净工作台)上进行,无菌室与无菌箱要经过喷雾除尘,并用药物或紫外线照射消毒(常用消毒药物为70%酒精,2%煤酚皂液,5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟)。
在没有上述设备条件时,在清洁房间里关闭门窗,避免空气流动,经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作,也可获得较好的结果。
一植物病真菌的分离培养
（三）组织表面消毒 最常用的表面消毒剂有0.1%升汞溶液和70%酒精溶液。组织表面消 毒时间，因不同材料而不同，一般用1-3分钟。
升汞溶液图片
（四）分离方法
1.取熔化的马铃薯培养基，温度降至40℃时滴入抑菌剂，摇匀 后将管口经酒精灯火焰上灭菌后将培养基注入灭菌皿内，轻轻 转动培养皿，使培养基迅速平铺皿底，制成平板。 2.取新鲜病叶病组织4-5小块（约0.2-0.3cm2），置70%酒精内1 秒钟降低表面张力，然后置0.1%升汞里消毒1-2分钟。 3.用灭菌镊子将消毒组织移入灭菌皿中，用灭菌水换洗三次。 4.然后用灭菌镊子小心将小块病组织小心、迅速移入培养基平 板上，每皿4-5块，均匀放置。
实验一 植物病真菌的分离培养
作 者：杨明秀
副教授
单 位：东北农业大学农学院
一、目的要求
学习植物病原真菌的一般分离培养方法。 二、材料
玉米大斑病叶片。
三、实验内容 （一）准备工作：分离工作应在清洁的环境下进行，最好在无菌操作箱内 进行，没有无菌操作室和无菌操作箱可以在普通洁净的实验室内进行。
（二）分离材料选择 取材料后选择新鲜、症状典型的病组织，一般分离时采用病健 组织交界部分作为分离材料。
5.将培养皿置于25℃温箱培养，一周后观查结果。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ结果图片
五、作业 每组进行病原菌分离，记录实验结果 ，写出实验报告，分析分离成功与失败的原 因。
玉米大斑病症状
Exserohilum turcicum 形态图
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植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
(一)分离材料的选择
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
(二)分离方法
病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离
A:分离前的准备工作：
1．工作环境的清洁和消毒
分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。
将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。
2．分离用具的消毒
凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。
再次使用时必须重复灭菌。
培养皿、试验等要经过干热灭菌。
培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。
3．分离材料的选择
用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。
任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料
B、植物病原菌的分离
1．叶斑类和枝杆病斑类（非维管束侵染）病原菌分离：
首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作：
①培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。
（为防止细菌污染，倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6滴）。
②病叶或病枝经自来水冲洗，从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下（若为枝干，则将带有病斑的皮层剥下，但）。
③取10毫升小烧杯经酒带消毒，放入分离材料，倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟，或用1%漂白粉消毒均可。
④消毒后倾出消毒液，用无菌水冲洗2——3，最后一次无菌水不要倒掉。
⑤用灭菌镊，剪在无菌水中将分离材料剪成2——3毫米大小的方块，每块组
织均应为病健相间组织。
用灭菌镊子夹取剪好的材料，放入培养基平板上，轻轻按压。
每皿4——5块，排放均匀。
⑥用蜡笔在培养皿上注明分离代号，日期、姓名，将培养皿翻转放置于23—25℃
⑦3——4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面培养基中央，于25℃温箱中培养。
2,稀释分离法：
稀释分离法适用于细菌、土壤菌及产生孢子多的真菌等病原菌的分离
以白菜软腐病为例
白菜软腐病最易伴生腐生细菌，分离时需以病组织接种健康菜帮上，经数次转种予以纯化，其纯化方法是将菜帮经多次换水冲洗后，再用无菌水洗三次，切成适当大小，放在15厘米直径的培养皿中，菜帮下衬以吸水纸保温。
用无菌解剖刀挑取病组织少许抹在菜帮的人为伤口上，培养在20—25℃下，经1天左右呈现腐烂，如此反复转种几次，至病斑纯净为止。
分离时，在新的水烂斑边缘挑取少量病组织在无菌水试管中配成菌悬液，取灭菌培养皿3付，标好次序，其内各置无菌水1毫升，用移置环移取菌悬液一环，放在第1皿水中混合均匀，从中挑取一环稀释液至第2皿，再以同法稀释成第3皿，取熔化后冷至45℃左右的(一般将化好的培养基瓶靠近鼻尖，以不烫为度)牛肉膏蛋白胨培养基，每皿倒约15毫升，沿着桌面轻轻摇匀，凝固后倒置于26—28℃的温箱中培养，1—2日后可见白色，圆形或近圆形直径为1—2毫米的菌落，从中选典型菌落用移植环（划线法）移入牛肉膏蛋白胨斜面培养基上培养，每组转4—5管，注意过早出现的大型菌落多为腐生细菌。
以上分离实验也可以划线法进行，方法是先取两付灭菌培养皿，每皿倒入约15毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，沿桌面轻轻摇匀，制成平板，然后用移置环沾取一环稀释好的菌悬液，在第一个培养皿平面培养基的左方长方形区内划平行线5—7条，再以此移置环继续向右(和左方小区内的几条平行线成一定角度)划5—7条平行线，依此法划两皿，倒置于26—28℃温箱中培养，1—2日后挑单个典型菌落移到斜面培养基上，培养待用。