黑曲霉葡萄糖酸发酵的工艺控制方法
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(2) 种子培养基 (g ·L - 1 ) :葡萄糖 (水解糖) 40 ,麸 皮 32 , ( N H4 ) 2 H PO4 01 4 , KH2 PO4 01 2 , MgSO4 · 7 H2 O 01 2 ,CaCO3 10 ,p H 值 51 6 。
(3) 发酵培养基 ( g ·L - 1 ) : 葡萄糖 (水解糖) 100 ～ 300 , ( N H4 ) 2 H PO4 01 4 , KH2 PO4 01 2 , MgSO4 · 7 H2 O 01 15 ,CaCO3 27～81 ,p H 值 51 6 。 11 11 3 主要仪器
21 40
21 27
转化率/ %
表1 Tab1 1
葡萄糖含量对摇瓶发酵产酸的影响 Effect of glucose content on production
of glucose acid in shake flask
葡萄糖含量/ %
10
20
葡萄糖酸浓度/ g ·L - 1
621 6
1191 1
残糖浓度/ g ·L - 1
21 87
1880 年 ,Bo ut ro ux 首先发现利用微生物的氧化作 用能将葡萄糖氧化成葡萄糖酸 。1924 年 ,Bernhager 发现采取添加碳酸钙中和酸的方法 ,黑曲霉菌能高效 地将葡萄糖转化成葡萄糖酸 。1933 年 ,Currie 等利用 青霉或曲霉采用现代通气搅拌深层发酵技术 ,在 48～ 60 h 内葡萄糖的转化率达 90 %。1952 年 ,Blo m 等发 明了添加 NaO H 、维持 p H 值 61 5 以下的方法生产葡 萄糖酸钠 ,葡萄糖转化率达 95 %以上 ,发酵时间缩短 到 20 h 以内 ,这种工艺形成了现代工业深层发酵的基 础 。1999 年 ,黄道震等[2] 以葡萄糖含量为 30 %的发酵 培养基接种 10 %的黑曲霉种子液 ,通气 、220 r ·min - 1 搅拌 、流加氢氧化钠溶液控制 p H 值 61 0～61 5 、温度 32～ 34 ℃、发 酵 20 h , 残 糖 可 降 至 1 g ·L - 1 以 下 。 2002 年 , A nastassiadis 等[3] 利 用筛 选得 到 的 短 梗 霉 ( A u reobasi di um p ul l ul ans) 在连续式搅拌发酵罐中进 行了静息细胞和固定化细胞的葡萄糖酸连续转化实 验 ,葡萄糖酸浓度可达 260 g ·L - 1 ,最高生成速率为 19 g ·L - 1 ·h - 1 。
表2
10 L 发酵罐中 pH值控制方式对 发酵产葡萄糖酸的影响
Tab1 2 Effect of control mode of pH value on production
of glucose acid in 10 L fermentator
图 2 10 L 发酵罐中溶氧含量与葡萄糖酸 浓度的动态变化曲线
化 学 与 生 物 工 程 2008 ,Vol. 25 No. 6
6 3
Chemistry & Bioengineering
黑曲霉葡萄糖酸发酵的工艺控制方法
蔡 皓1 ,余 超1 ,2 ,李 庆3 (11 华中农业大学生命科学技术学院 ,湖北 武汉 430070 ;21 华东理工大学生物工程学院 ,上海 200237 ;
还原糖的浓度用生物传感分析仪以生物酶膜电极 法测定 。
21 11 1 摇瓶实验 在葡萄糖含量分别为 10 %、20 %和 30 %的发酵培
养基中分别添加 27 g ·L - 1 、54 g ·L - 1 、81 g ·L - 1 CaCO3 ,摇瓶发酵 30 h ,考察葡萄糖含量对黑曲霉产酸 的影响 ,结果见表 1 。
glucose acid in 10 L fermentator
蔡 皓等 :黑曲霉葡萄糖酸发酵的工艺控制方法/ 2008 年第 6 期
6 5
21 2 p H值的控制方式 黑曲霉在葡萄糖酸的生成过程中 p H 值会不断下
降 ,若降至 41 5 以下会导致柠檬酸的生成 ,为此需对发 酵过程中 p H 值进行控制 ,一般可通过添加碳酸盐 、金 属氧化物和碱来实行 。在 10 L 发酵罐 (装液量 61 5 L , 葡萄糖 含 量 20 %) 中 分 别 采 用 NaO H 、Ca ( O H ) 2 、 CaCO3 来控制 p H 值 ,考察了不同控制方式对黑曲霉 发酵产酸的影响 ,结果见表 2 。
收稿日期 :2008 - 01 - 22 作者简介 :蔡皓 (1970 - ) ,男 ,湖北武汉人 ,硕士 ,讲师 ,主要从事微生物发酵及后提取的研究 ; 通讯联系人 : 李庆 ,博士 ,讲师 。E2
mail :liqing @mail. hzau. edu. cn 。
6 4
蔡 皓等 :黑曲霉葡萄糖酸发酵的工艺控制方法/ 2008 年第 6 期
S H Z282 型恒温振荡器 ,金坛市富华仪器有限公 司 ; S KP201B 型电热恒温箱 ,湖北黄石恒丰医疗器械 有限公司 ; SBA240C 型生物传感分析仪 ,山东微生物 研究所 ; FL C23 型超净工作 台 , 哈尔 滨市 东联 公司 ; 722S 型可见分光光度计 ,上海精密科学仪器有限公 司 ; TD522 型自动平衡离心机 ,长沙平凡仪器有限公
取孢子悬液接入发酵培养基中 (250 mL 三角瓶中 装液量为 30 mL) 置于 33 ℃、250 r ·min - wk.baidu.com 摇床培养 , 发酵结束后测残糖及葡萄糖酸的浓度 。 11 21 3 发酵罐发酵
10 L 发酵罐装料 7 L ,接种 10 %的黑曲霉种子悬 液 ,搅拌转速 250 r ·min - 1 ,无菌空气流量 01 4 m3 · h - 1 ,维持温度 33 ℃,流加 30 %的碱液维持 p H 值 51 6 。 残糖含量降至 01 5 %以下时 ,结束发酵 。 11 21 4 分析与检测 11 21 41 1 葡萄糖酸钙中葡萄糖酸浓度的测定
×M
式中 : cE 为所用 ED TA 的浓度 , mol ·L - 1 ; M 为 葡萄糖酸的摩尔质量 ,196 g ·mol - 1 ;V E 为所用 ED2 TA 的体积 ,mL ; V S 为所取用的待标定溶液的体积 , mL 。 11 21 41 2 葡萄糖酸钠中葡萄糖酸浓度的测定
可见分光光度法[5] :发酵过程中葡萄糖酸的生成 导致发酵液 p H 值下降 ,利用 NaO H 与葡萄糖酸中和 来维持发酵 p H 值时 ,生成葡萄糖酸的钠盐 ,其葡萄糖 酸根可与 Cu2 + 、Fe3 + 等金属离子发生络合反应 ,加热 后呈现一定的颜色 ,660 nm 波长下可测定其吸收值 , 由标准曲线方程推算可知葡萄糖酸的浓度 。 11 21 41 3 还原糖浓度的测定
关键词 :黑曲霉 ;葡萄糖酸 ;发酵 ;底物抑制 ;p H 值控制 ;溶氧 ;含量 中图分类号 : TQ 9211 2 文献标识码 :A 文章编号 :1672 - 5425 (2008) 06 - 0063 - 04
葡萄糖酸及其盐类广泛应用于食品 、化工 、水处 理 、建材和医药工业[1] 。目前葡萄糖酸生产包括化学 催化法 、电解法和发酵法 。
Fig. 2 The dynamic curves of dissolved oxygen content and concentration of glucose acid in 10 L fermentator
p H 值控制方式
流加 流加 Ca (O H) 2 添加
NaO H
乳浊液 CaCO3
ED TA 定钙法[4] :发酵过程中葡萄糖酸的生成导 致发酵液 p H 值下降 ,利用 Ca (O H) 2 及 CaCO3 与葡萄 糖酸中和来维持发酵 p H 值时 ,生成葡萄糖酸的钙盐 , 通过直接测定发酵液中钙离子的含量可折算得到生成 的葡萄糖酸浓度 ( W G) 。
W
G
=
cE
×V V
E S
31 华中农业大学理学院 ,湖北 武汉 430070)
摘 要 :针对葡萄糖酸生产菌 ———黑曲霉 ,在 10 L 发酵罐进行了其发酵工艺控制研究 。结果表明 ,高含量葡萄糖对 黑曲霉生成葡萄糖酸没有抑制作用 ,较好的葡萄糖控制方式为维持葡萄糖含量 20 %左右 ,总糖含量为 30 %。流加 30 % NaO H 溶液 、流加 25 %～30 % Ca (O H) 2 乳浊液 、分批添加 CaCO3 等 3 种方式都能很好地控制 p H 值 ,但各有适用范围 ; 通过调整搅拌转速的方式维持溶氧含量 50 %左右 ,可提高产葡萄糖酸性能 ,并能降低搅拌能耗 。
司 ;10 L 发酵罐 ,武汉 709 所 130 工厂 (罐体 、管路) 、 上海理工大学 (自控) 。 11 2 方法 11 21 1 种子培养
250 mL 三角瓶中装液量为 30 mL ,接种后置于 30 ℃、220 r ·min - 1 摇床培养 18～20 h 。 11 21 2 摇瓶发酵培养
作者曾参与化学法年产 5000 t 葡萄糖酸钠项目 中四效蒸发器的改造工程 ,在成功改造的基础上 ,改造 单位提出了葡萄糖酸生产改化学法为发酵法的工艺思 路 。为此 ,在对葡萄糖酸生产菌 ———黑曲霉进行大量
葡萄糖酸摇瓶发酵研究的基础上 ,又对其 10 L 发酵罐 发酵工艺控制进行了研究 。
1 实验
11 1 材料和仪器 11 11 1 菌种
黑曲霉 ( A s per gi l l us ni ger) ,购于武汉大学菌种 保藏中心 。 11 11 2 培养基
(1) 查 氏 培 养 基 ( g ·L - 1 ) : 蔗 糖 30 , NaNO3 4 , MgSO4 ·7 H2 O 01 5 , KCl 01 5 ; FeSO4 01 1 , K2 H PO4 1 , 琼脂 20 ,p H 值 51 5 ,温度 31 ℃。
21 1 葡萄糖含量的控制方式 葡萄糖在较高含量下 ,对许多微生物的生长和代
谢都有抑制作用 ,使菌体生长速率和产物生成速率处 于较低水平 ,发酵时间大大延长 。
图 1 10 L 发酵罐中不同发酵方式对发酵产酸的影响 Fig. 1 Effect of mode of fermentation on production of
在 10 L 发酵罐中分别进行了 30 %糖含量 、81 g · L - 1 CaCO3 的分批发酵和初糖含量 20 %、CaCO3 初浓 度 50 g ·L - 1 流加总糖含量至 30 %、CaCO3 总量至 81 g ·L - 1 的分批补料发酵对比实验 ,结果如图 1 所示 。
2 结果与讨论
61 49
转化率/ %
801 0
811 0
葡萄糖平均消耗速率/ g ·L - 1 ·h - 1 21 38
41 50
葡萄糖酸平均生成速率/ g ·L - 1 ·h - 1 21 09
31 97
30 1071 8 141 74 641 9 51 09 31 59
由表 1 可见 ,随着葡萄糖含量的增加 ,葡萄糖平均 消耗速率加快 ,这说明高含量的葡萄糖对黑曲霉的生 成和代谢没有抑制作用 。从发酵糖酸转化率和葡萄糖 酸平均生成速率上来看 ,糖含量为 20 %时最高 。若采 用 30 %葡萄糖摇瓶 ,培养基中葡萄糖浓度和 CaCO3 浓 度太高 ,培养基粘度太大 ,严重阻碍了氧的溶解与传 递 ,副产物生成量增加 ,导致转化率和葡萄糖酸平均生 成速率下降 。为此 ,可以采取初糖含量为 20 %、分批 流加葡萄糖至 30 %和分批添加 CaCO3 至总量 81 g · L - 1 的方法来进行发酵工艺控制 。 21 11 2 10 L 发酵罐实验
pH 值
51 6
51 6
51 0～51 5
发酵时间/ h
43
65
67
残糖浓度/ g ·L - 1
9
61 8
10
葡萄糖酸浓度/ g ·L - 1
170
156
152
葡萄糖平均消耗速率/ g ·L - 1 ·h - 1 41 06
31 16
21 84
葡萄糖酸平均生成速率/ g ·L - 1 ·h - 1 41 05
(3) 发酵培养基 ( g ·L - 1 ) : 葡萄糖 (水解糖) 100 ～ 300 , ( N H4 ) 2 H PO4 01 4 , KH2 PO4 01 2 , MgSO4 · 7 H2 O 01 15 ,CaCO3 27～81 ,p H 值 51 6 。 11 11 3 主要仪器
21 40
21 27
转化率/ %
表1 Tab1 1
葡萄糖含量对摇瓶发酵产酸的影响 Effect of glucose content on production
of glucose acid in shake flask
葡萄糖含量/ %
10
20
葡萄糖酸浓度/ g ·L - 1
621 6
1191 1
残糖浓度/ g ·L - 1
21 87
1880 年 ,Bo ut ro ux 首先发现利用微生物的氧化作 用能将葡萄糖氧化成葡萄糖酸 。1924 年 ,Bernhager 发现采取添加碳酸钙中和酸的方法 ,黑曲霉菌能高效 地将葡萄糖转化成葡萄糖酸 。1933 年 ,Currie 等利用 青霉或曲霉采用现代通气搅拌深层发酵技术 ,在 48～ 60 h 内葡萄糖的转化率达 90 %。1952 年 ,Blo m 等发 明了添加 NaO H 、维持 p H 值 61 5 以下的方法生产葡 萄糖酸钠 ,葡萄糖转化率达 95 %以上 ,发酵时间缩短 到 20 h 以内 ,这种工艺形成了现代工业深层发酵的基 础 。1999 年 ,黄道震等[2] 以葡萄糖含量为 30 %的发酵 培养基接种 10 %的黑曲霉种子液 ,通气 、220 r ·min - 1 搅拌 、流加氢氧化钠溶液控制 p H 值 61 0～61 5 、温度 32～ 34 ℃、发 酵 20 h , 残 糖 可 降 至 1 g ·L - 1 以 下 。 2002 年 , A nastassiadis 等[3] 利 用筛 选得 到 的 短 梗 霉 ( A u reobasi di um p ul l ul ans) 在连续式搅拌发酵罐中进 行了静息细胞和固定化细胞的葡萄糖酸连续转化实 验 ,葡萄糖酸浓度可达 260 g ·L - 1 ,最高生成速率为 19 g ·L - 1 ·h - 1 。
表2
10 L 发酵罐中 pH值控制方式对 发酵产葡萄糖酸的影响
Tab1 2 Effect of control mode of pH value on production
of glucose acid in 10 L fermentator
图 2 10 L 发酵罐中溶氧含量与葡萄糖酸 浓度的动态变化曲线
化 学 与 生 物 工 程 2008 ,Vol. 25 No. 6
6 3
Chemistry & Bioengineering
黑曲霉葡萄糖酸发酵的工艺控制方法
蔡 皓1 ,余 超1 ,2 ,李 庆3 (11 华中农业大学生命科学技术学院 ,湖北 武汉 430070 ;21 华东理工大学生物工程学院 ,上海 200237 ;
还原糖的浓度用生物传感分析仪以生物酶膜电极 法测定 。
21 11 1 摇瓶实验 在葡萄糖含量分别为 10 %、20 %和 30 %的发酵培
养基中分别添加 27 g ·L - 1 、54 g ·L - 1 、81 g ·L - 1 CaCO3 ,摇瓶发酵 30 h ,考察葡萄糖含量对黑曲霉产酸 的影响 ,结果见表 1 。
glucose acid in 10 L fermentator
蔡 皓等 :黑曲霉葡萄糖酸发酵的工艺控制方法/ 2008 年第 6 期
6 5
21 2 p H值的控制方式 黑曲霉在葡萄糖酸的生成过程中 p H 值会不断下
降 ,若降至 41 5 以下会导致柠檬酸的生成 ,为此需对发 酵过程中 p H 值进行控制 ,一般可通过添加碳酸盐 、金 属氧化物和碱来实行 。在 10 L 发酵罐 (装液量 61 5 L , 葡萄糖 含 量 20 %) 中 分 别 采 用 NaO H 、Ca ( O H ) 2 、 CaCO3 来控制 p H 值 ,考察了不同控制方式对黑曲霉 发酵产酸的影响 ,结果见表 2 。
收稿日期 :2008 - 01 - 22 作者简介 :蔡皓 (1970 - ) ,男 ,湖北武汉人 ,硕士 ,讲师 ,主要从事微生物发酵及后提取的研究 ; 通讯联系人 : 李庆 ,博士 ,讲师 。E2
mail :liqing @mail. hzau. edu. cn 。
6 4
蔡 皓等 :黑曲霉葡萄糖酸发酵的工艺控制方法/ 2008 年第 6 期
S H Z282 型恒温振荡器 ,金坛市富华仪器有限公 司 ; S KP201B 型电热恒温箱 ,湖北黄石恒丰医疗器械 有限公司 ; SBA240C 型生物传感分析仪 ,山东微生物 研究所 ; FL C23 型超净工作 台 , 哈尔 滨市 东联 公司 ; 722S 型可见分光光度计 ,上海精密科学仪器有限公 司 ; TD522 型自动平衡离心机 ,长沙平凡仪器有限公
取孢子悬液接入发酵培养基中 (250 mL 三角瓶中 装液量为 30 mL) 置于 33 ℃、250 r ·min - wk.baidu.com 摇床培养 , 发酵结束后测残糖及葡萄糖酸的浓度 。 11 21 3 发酵罐发酵
10 L 发酵罐装料 7 L ,接种 10 %的黑曲霉种子悬 液 ,搅拌转速 250 r ·min - 1 ,无菌空气流量 01 4 m3 · h - 1 ,维持温度 33 ℃,流加 30 %的碱液维持 p H 值 51 6 。 残糖含量降至 01 5 %以下时 ,结束发酵 。 11 21 4 分析与检测 11 21 41 1 葡萄糖酸钙中葡萄糖酸浓度的测定
×M
式中 : cE 为所用 ED TA 的浓度 , mol ·L - 1 ; M 为 葡萄糖酸的摩尔质量 ,196 g ·mol - 1 ;V E 为所用 ED2 TA 的体积 ,mL ; V S 为所取用的待标定溶液的体积 , mL 。 11 21 41 2 葡萄糖酸钠中葡萄糖酸浓度的测定
可见分光光度法[5] :发酵过程中葡萄糖酸的生成 导致发酵液 p H 值下降 ,利用 NaO H 与葡萄糖酸中和 来维持发酵 p H 值时 ,生成葡萄糖酸的钠盐 ,其葡萄糖 酸根可与 Cu2 + 、Fe3 + 等金属离子发生络合反应 ,加热 后呈现一定的颜色 ,660 nm 波长下可测定其吸收值 , 由标准曲线方程推算可知葡萄糖酸的浓度 。 11 21 41 3 还原糖浓度的测定
关键词 :黑曲霉 ;葡萄糖酸 ;发酵 ;底物抑制 ;p H 值控制 ;溶氧 ;含量 中图分类号 : TQ 9211 2 文献标识码 :A 文章编号 :1672 - 5425 (2008) 06 - 0063 - 04
葡萄糖酸及其盐类广泛应用于食品 、化工 、水处 理 、建材和医药工业[1] 。目前葡萄糖酸生产包括化学 催化法 、电解法和发酵法 。
Fig. 2 The dynamic curves of dissolved oxygen content and concentration of glucose acid in 10 L fermentator
p H 值控制方式
流加 流加 Ca (O H) 2 添加
NaO H
乳浊液 CaCO3
ED TA 定钙法[4] :发酵过程中葡萄糖酸的生成导 致发酵液 p H 值下降 ,利用 Ca (O H) 2 及 CaCO3 与葡萄 糖酸中和来维持发酵 p H 值时 ,生成葡萄糖酸的钙盐 , 通过直接测定发酵液中钙离子的含量可折算得到生成 的葡萄糖酸浓度 ( W G) 。
W
G
=
cE
×V V
E S
31 华中农业大学理学院 ,湖北 武汉 430070)
摘 要 :针对葡萄糖酸生产菌 ———黑曲霉 ,在 10 L 发酵罐进行了其发酵工艺控制研究 。结果表明 ,高含量葡萄糖对 黑曲霉生成葡萄糖酸没有抑制作用 ,较好的葡萄糖控制方式为维持葡萄糖含量 20 %左右 ,总糖含量为 30 %。流加 30 % NaO H 溶液 、流加 25 %～30 % Ca (O H) 2 乳浊液 、分批添加 CaCO3 等 3 种方式都能很好地控制 p H 值 ,但各有适用范围 ; 通过调整搅拌转速的方式维持溶氧含量 50 %左右 ,可提高产葡萄糖酸性能 ,并能降低搅拌能耗 。
司 ;10 L 发酵罐 ,武汉 709 所 130 工厂 (罐体 、管路) 、 上海理工大学 (自控) 。 11 2 方法 11 21 1 种子培养
250 mL 三角瓶中装液量为 30 mL ,接种后置于 30 ℃、220 r ·min - 1 摇床培养 18～20 h 。 11 21 2 摇瓶发酵培养
作者曾参与化学法年产 5000 t 葡萄糖酸钠项目 中四效蒸发器的改造工程 ,在成功改造的基础上 ,改造 单位提出了葡萄糖酸生产改化学法为发酵法的工艺思 路 。为此 ,在对葡萄糖酸生产菌 ———黑曲霉进行大量
葡萄糖酸摇瓶发酵研究的基础上 ,又对其 10 L 发酵罐 发酵工艺控制进行了研究 。
1 实验
11 1 材料和仪器 11 11 1 菌种
黑曲霉 ( A s per gi l l us ni ger) ,购于武汉大学菌种 保藏中心 。 11 11 2 培养基
(1) 查 氏 培 养 基 ( g ·L - 1 ) : 蔗 糖 30 , NaNO3 4 , MgSO4 ·7 H2 O 01 5 , KCl 01 5 ; FeSO4 01 1 , K2 H PO4 1 , 琼脂 20 ,p H 值 51 5 ,温度 31 ℃。
21 1 葡萄糖含量的控制方式 葡萄糖在较高含量下 ,对许多微生物的生长和代
谢都有抑制作用 ,使菌体生长速率和产物生成速率处 于较低水平 ,发酵时间大大延长 。
图 1 10 L 发酵罐中不同发酵方式对发酵产酸的影响 Fig. 1 Effect of mode of fermentation on production of
在 10 L 发酵罐中分别进行了 30 %糖含量 、81 g · L - 1 CaCO3 的分批发酵和初糖含量 20 %、CaCO3 初浓 度 50 g ·L - 1 流加总糖含量至 30 %、CaCO3 总量至 81 g ·L - 1 的分批补料发酵对比实验 ,结果如图 1 所示 。
2 结果与讨论
61 49
转化率/ %
801 0
811 0
葡萄糖平均消耗速率/ g ·L - 1 ·h - 1 21 38
41 50
葡萄糖酸平均生成速率/ g ·L - 1 ·h - 1 21 09
31 97
30 1071 8 141 74 641 9 51 09 31 59
由表 1 可见 ,随着葡萄糖含量的增加 ,葡萄糖平均 消耗速率加快 ,这说明高含量的葡萄糖对黑曲霉的生 成和代谢没有抑制作用 。从发酵糖酸转化率和葡萄糖 酸平均生成速率上来看 ,糖含量为 20 %时最高 。若采 用 30 %葡萄糖摇瓶 ,培养基中葡萄糖浓度和 CaCO3 浓 度太高 ,培养基粘度太大 ,严重阻碍了氧的溶解与传 递 ,副产物生成量增加 ,导致转化率和葡萄糖酸平均生 成速率下降 。为此 ,可以采取初糖含量为 20 %、分批 流加葡萄糖至 30 %和分批添加 CaCO3 至总量 81 g · L - 1 的方法来进行发酵工艺控制 。 21 11 2 10 L 发酵罐实验
pH 值
51 6
51 6
51 0～51 5
发酵时间/ h
43
65
67
残糖浓度/ g ·L - 1
9
61 8
10
葡萄糖酸浓度/ g ·L - 1
170
156
152
葡萄糖平均消耗速率/ g ·L - 1 ·h - 1 41 06
31 16
21 84
葡萄糖酸平均生成速率/ g ·L - 1 ·h - 1 41 05