过氧化物酶活性的测定
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三、材料、设备和原理
1.材料马铃薯块茎
2.设备光光度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管
3.试剂已配置好的反应混合液、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液
四、操作方法
1.酶液制备
2．比色测定
五、实验结果
10分钟内测定的酶液吸光度
时间（min）0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
园艺学院设施201402李密
实验三
（一）过氧化物酶活性的测定（愈创木酚法）
一、实验目的
通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法和原理。
二、实验原理
以愈创木酚为底物，在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470 nm波长处有最大光吸收值，故可通过测470 nm波长下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。
掌握测量可溶性蛋白的方法及其原理。
二、实验原理
可溶性蛋白质与考马斯蓝G-250反应生成青色产物，在595nm波长有最大吸收峰，其颜色深浅与可溶性蛋白含量成正相关，可用分光光度法测定可溶性蛋白的含量。
三、材料、设备和原理
1.材料马铃薯提取液
2.设备分光光度计、10ml刻度试管、移液管
3.试剂考马斯蓝G-250、100μg/ml标准蛋白液
A4700.126 0.257 0.385 0.513 0.602 0.694 0.789 0.875 0.999 1.041 1.119
计算：
酶活力（0.01A470/min）
245.0
酶的比活力（μ/g）
六、讨论
1、由于仪器较少,等待测POD值的时间较长,且没有放在低温下保持。导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。
2、测定中，蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
3、其他的测定蛋白质的方法，与考纳斯蓝比色法比较存在的优缺点。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
2、理论上POD值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系。可能原因有 ①把酶液加入到3ml反应混合液时，反应太快，待到1min读取POD值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。②离心出来的酶液在室温下放置时间过长。
（二）可溶性蛋白质含量的测定（考马斯蓝G-250法）
一、实验目的
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
考马斯亮蓝法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
浓度（μg/ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
A5950 0.126 0.219 0.344 0.468 0.597
计算：
实验测得马铃薯提取液的吸光度值为0.106
由Y=0.0059x得
x=0.106/0.0059
=17.97μg/ml
蛋白含量 ×
六、讨论
1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。
四、操作方法
1.标准曲线制作
试剂
0号
1号
2号
3号
4号
5号
标准蛋白体积/ml
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
蒸馏水体积/ml
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
考马斯蓝G-250/ml
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量/g
0பைடு நூலகம்
20
40
60
80
100
2.样品液测定
五、实验结果
标准蛋白液的吸光度值
1.材料马铃薯块茎
2.设备光光度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管
3.试剂已配置好的反应混合液、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液
四、操作方法
1.酶液制备
2．比色测定
五、实验结果
10分钟内测定的酶液吸光度
时间（min）0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
园艺学院设施201402李密
实验三
（一）过氧化物酶活性的测定（愈创木酚法）
一、实验目的
通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法和原理。
二、实验原理
以愈创木酚为底物，在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470 nm波长处有最大光吸收值，故可通过测470 nm波长下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。
掌握测量可溶性蛋白的方法及其原理。
二、实验原理
可溶性蛋白质与考马斯蓝G-250反应生成青色产物，在595nm波长有最大吸收峰，其颜色深浅与可溶性蛋白含量成正相关，可用分光光度法测定可溶性蛋白的含量。
三、材料、设备和原理
1.材料马铃薯提取液
2.设备分光光度计、10ml刻度试管、移液管
3.试剂考马斯蓝G-250、100μg/ml标准蛋白液
A4700.126 0.257 0.385 0.513 0.602 0.694 0.789 0.875 0.999 1.041 1.119
计算：
酶活力（0.01A470/min）
245.0
酶的比活力（μ/g）
六、讨论
1、由于仪器较少,等待测POD值的时间较长,且没有放在低温下保持。导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。
2、测定中，蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
3、其他的测定蛋白质的方法，与考纳斯蓝比色法比较存在的优缺点。
目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
2、理论上POD值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系。可能原因有 ①把酶液加入到3ml反应混合液时，反应太快，待到1min读取POD值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。②离心出来的酶液在室温下放置时间过长。
（二）可溶性蛋白质含量的测定（考马斯蓝G-250法）
一、实验目的
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
考马斯亮蓝法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
浓度（μg/ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
A5950 0.126 0.219 0.344 0.468 0.597
计算：
实验测得马铃薯提取液的吸光度值为0.106
由Y=0.0059x得
x=0.106/0.0059
=17.97μg/ml
蛋白含量 ×
六、讨论
1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。
四、操作方法
1.标准曲线制作
试剂
0号
1号
2号
3号
4号
5号
标准蛋白体积/ml
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
蒸馏水体积/ml
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
考马斯蓝G-250/ml
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量/g
0பைடு நூலகம்
20
40
60
80
100
2.样品液测定
五、实验结果
标准蛋白液的吸光度值