钩虫抗凝血肽的研究现状

文章编号)1005-4057(2006)06-0624-04综

述

钩虫抗凝血肽的研究现状

彭礼飞 王会兰 邓

莉(综述) 戴世忠(校审)

(广东医学院寄生虫学教研室 广东湛江5Z 40Z 3)

基金项目)广东省自然科学基金项目资助(NO 04011381)

收稿日期)Z 006-09-05; 修订日期)Z 006-11-01

作者简介)彭礼飞(1970-) 男 博士 副教授 硕士研究生导师 研究方向,寄生虫生物学 E -mail ,lifpeng sina .Com O

关键词)钩虫;抗凝血肽;综述文献钩虫(hookWorm )是钩口科线虫的统称 至少包括17个属100余种O 钩虫在长期进化过程中为适应摄食而形成了有效的抗血液凝固机制 钩虫分泌的抗凝物质是其抗血液凝固的基础O 目前已报道的这些抗凝成分包括6种抗凝血肽[1-3]和1种血小板聚集抑制剂(~PI )[4]O 早在Z 0世纪初 就有学者证实了犬钩虫提取物具有抗凝作用 但直到1993年才从犬钩虫中分离出首个抗凝血肽[5] 其后并证实该抗凝血肽可显著延长凝血酶原时间(PT )和活化部分凝血酶原激酶时间(aPTT ) 其延长PT 比重组蜱抗凝肽rTAP 和重组水蛭素r~IR 更有效 由此被认为是最有效的天然抗凝血分子之一O 该抗凝肽被命名为犬钩虫抗凝血肽(A7cyl0st0?C cC7z7/?antiCoagulant peptide ACAP ) 也称线虫抗凝血肽(nematode antiCoagulant peptide NAP )或线虫抗凝血蛋白(nematode antiCoagulant protein NAP )[6]O 1996年 Stassens 等用核酸探针技术从犬钩虫CDNA 文库中筛选到三个抗凝血肽基因 它们在Pzc zC pCst01zs 中的表达产物rACAP 5(rNAP 5)~rACAP 6(rNAP 6)和rACAPC Z (rNAPC Z )均显著延长PT 并成剂量依赖关系 其中 以rACAPC Z 最为高效[1]O Z 00Z 年 Stassens 等报道了采用CDNA 末端快速扩增技术 从锡兰钩虫(A7cyl0st0?C ceylC7zc/?)中得到了抗凝血肽ACeAP 1基因 并在大肠杆菌中表达获得了rACeAP 1O rACeAP 1能延长

aPTT 但其作用效果不到rACAP 5的百分之一[Z ]

O Z 004年 Juliusz 等人报道了根据ACAPC Z 保守序列设计引物 采用RT -PCR 从犬钩虫中获得两种同源多肽 并分别命名为ACAPC 3~ACAPC 4O rACAPC 3~rACAPC 4的抗凝作用与rACAPC Z 有相似之处 即在低浓度下能较显著延长PT 但对aPTT 影响不大O 钩虫抗凝肽及其重组产物具有明确的抗凝血作用 其抗凝效应已引起人们的重视并探讨应用于临床实践 rACAPC Z (rNAPC Z )和rACAP 5(rNAP 5)的临床或临床前试验表明它们具有广阔的应用前景O 本文就其抗凝血肽的研究现状作一综述O

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钩虫抗凝血肽的结构与功能

成熟的钩虫抗凝血肽由75~84个氨基酸组成 分子量约为

8.4~9.77Kda 都具有较高的同源性和相似的结构 属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族 具有10个半胱氨酸和酸性pI O 钩虫抗凝血肽由前体加工而来 ACAP 5~ACAP 6~ACeAP 1~ACAPC 4的信号肽由17~19个氨基酸组成 其中ACAP 5~ACAP 6有4个氨基酸组成的前导肽 而ACeAP 1~ACAPC 4无前导肽[1-3]O 钩虫抗凝肽的信号肽氨基酸序列比较保守 具有较高的相似性O

与已知的非吸血线虫(如蛔虫)丝氨酸蛋白酶抑制剂家族相比较 钩虫抗凝血肽的10个半胱氨酸残基的结构模式表明它是线虫丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的一个亚群O 钩虫抗凝血肽有与从似蚓蛔线虫分离出的胰蛋白酶抑制剂ATI ~胰蛋白酶/弹性蛋白酶抑制剂C /E -I 类似的反应位点[1]O ACAP 5与底物fxa 的反应位区在肽37-4Z (-C -R -S -R -G -C -) 作用位点在R 40和G 41之间O ACAP 6与底物fxa 的反应位区在肽35-40(-C -R -S -F -S -C -) 作用位点在F 38和S 39之间O ACAP 5对fxa 的抑制活性稍强于ACAp 6 但如果rACAP 6的F 38突变为R 38(即rACAP 6F 38R ) 则其抑制fxa 的能力与rACAP 5相近O rACAP 5的突变体rACAP 5R 40A 对fxa 的抑制能力比rACAP 5有明显降低[7]O 这些结果表明作为fxa 抑制剂的ACAP 5的反应位点中的精氨酸(R 40)对fxa 的抑制活性起重要作用O 在对fxa 及fVII /TF 均有抑制活性的rACeAP 1活性位点(反应位区在肽37-4Z ,-C -L -S -R -D -C -))研究中 突变体rACeAP 1R 40A 对fxa 的抑制活性比rACeAP 1也有降低[7] 进一步支持了精氨酸在fxa 的抑制活性中的重要作用 也表明R 40及D 41之间是rACeAP 1对fxa 的作用位点O ACAPC Z 的反应位区在肽41-45(-C -L -V -R -V -C -) 序列-L -V -R -类似于fVIIa 识别底物fxa 和fIxa 的序列-L -T -R -[8]

O 同样类似的是 ACAPC 3和ACAPC 4的相应序列分别为-L -V -R -和-L -I -R -O 突变体rACeAP 1R 40A 和rACAPC 4R 41A 对

fVII /TF 均无抑制活性[7]

表明了这些抗凝血肽反应位区中的精氨酸位点对于维持对fVII /TF 的抑制活性的重要作用O

钩虫抗凝血肽的10个半胱氨酸形成的5对分子内二硫键 对蛋白的结构和功能起重要作用O 目前对rACAPC Z 的三维结构

已有较完整的研究O 根据NMR 谱 rACAPC Z 核心结构主要由二硫键构成 rNAPC Z 具有两个分别由两条链组成的反向平行的B 折叠结构(分别由E 10-D 13和G 48-C 5Z ~Y 57-R 58和C 64-V 65组成)和一个短的O 螺旋结构(由A 67-D 73形成) 在这些结构之间的环区具有高度的构象可塑性 而这种可塑性正是构成其发挥

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Z 6第Z 4卷第6期Z 006年1Z 月

广东医学院学报

JO !RNAL OF G !ANGDONG MEDICAL COLLEGE

Vol "Z 4No "6DeC.Z 006