基因工程综合实验

基因工程综合实验

马正文

生物13班 130434109

摘要：20世纪80年代以来,基因工程技术在农业上的应用取得了斐然成果,植物基因工程已成为农业绿色革命的最重要技术手段。为此对植物基因工程中目的基因的克隆，植物表达载体构建与目的基因的转化以及转基因植株的检测的研究进展作了综合评述。

1.目的基因克隆

1.1实验目的

1.11 通过PCR法分离克隆目的基因。

1.12 熟悉掌握PCR、凝胶电泳、DNA回收纯化、PCR产物与T载体链接、大肠杆菌感受态细胞制备、连接产物转化、重组子筛选等一系列克隆相关技术

1.2实验原理

基于已知序列或已知同源基因序列，设计基因特异引物或简并引物，以DNA或cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物电泳后回收纯化，与T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经抗性筛选和PCR检测、质粒酶切鉴定获得重组子。

1.3实验试剂药品及仪器设备

1.3．1试剂药品

PCR反应试剂(Taq DNA polymerase, 10×PCR Buffer (Mg2+)，2.5mM dNTPs, Primers(合成))

1×TAE, CaCl2，无水乙醇、LB培养基

DNA 回收试剂盒，质粒DNA提取试剂盒，DNA marker

T-Vector, T4-DNA ligase,

质粒DNA提取试剂盒

常用限制性核酸内切酶

1.3.2仪器设备

PCR仪、电泳装置、离心机、恒温箱、摇床、凝胶成像仪、移液器等

耗材：PCR管、离心管、吸头、培养皿等

1.4实验步骤

1．4.1PCR

1.4.1．1PCR原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

1.4..1.2PCR反应体系

DNA模板 1 l

上游引物(10pmol/ l) 1 l

下游引物(10pmol/ l) 1 l

10×PCR Buffer 5 l

25mM MgCl2 4 l

2.5mM dNTPs 4 l

Taq(4,5units/ l) 0.5 l

ddH2O 33.5 l

total 50 l

或

DNA模板 1 l

上游引物(10pmol/ l) 3 l

下游引物(10pmol/ l) 3 l

10×PCR Buffer 5 l

10mM dNTP (each) 1 l

Pfu(2,3units/ l) 0.5 l

ddH2O 36.5 l

total 50 l

1.4.1.3模板DNA可以是基因组DNA、DNA片段、cDNA、质粒DNA或含目标DNA的细菌及病毒等，浓度一般小于100ng。

1.4.1.4引物设计应遵循下列原则：

(1) 长度一般在20-24碱基;

(2) 与模板DNA的配对同源性在80%以上;

(3) 上游引物与基因编码链序列一致, 下游引物则与之互补;

(4) 3’未端与模板配对能力较好(最好未端5个碱基能配对);

(5) 两引物G+C百分含量相近;

(6) 3’未端不出现3个连续的G/C;

(7) 引物自身或两引物间不存在连续5个或5个以上碱基的互补能力;

(8) 两引物3’未端序列不应相近;

(9) 目标PCR产物的长度应能预测;

(10) 经GenBank同源性检索, 目标基因与引物的配对能力应远强于其它基因。

1.4.1.5循环条件：

一般情况下Taq采用94℃, 5min → (94℃, 40s → 退火温度, 40s →72℃, 60-120s)30 → 72℃, 10min。Pfu采用95℃, 2min → (95℃, 40s → 退火温度, 30s →73℃, 60-240s)35 → 73℃, 5min。退火温度是PCR成败的关键，虽然根据引物的特性可估计退火温度，但更多情况下是通过试验确定退火温度，一般为45-60℃。退火温度大致可按下式推算：

Tm=4(G+C)+2(A+T)-5n， n代表错配的碱基数。延伸时间Taq是每kb 1min, Pfu则每kb 2min。1．4.2琼脂糖凝胶电泳

1．4.2.1胶的浓度因DNA长度而异：

基因组DNA， DNA 0.4-0.5%

质粒(3-5kb) 0.7%

3-1kb 0.7-1.0%

1-0.5kb 1.0-1.5%

<0.5kb 2.0%

1.4.

2.2 电泳缓冲液可选用0.5×TBE或1×TAE，前者缓冲能力较后者强，但不适用于从胶中回收DNA，建议只采用1×TAE用于琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖用电泳缓冲液配制。

1.4.

2.3电泳电压以5V/cm为宜, 即电泳槽的长度×5。

1.4.

2.4电泳胶中添加0.5g/ml EB。

1.4.

2.5DNA样品与6×上样缓冲液混合后点样，为使DNA条带肉眼可见，条带DNA必须达2ng。

1.4.

2.6采用合适的DNA Marker。

1.4.3PCR产物与T－载体连接

反应体系：0.1μg载体DNA，2-5μl PCR纯化产物，1μl连接缓冲液，1μl(3units/l) T4 DNA连接酶，加ddH2O至10μl，12-16℃连接过夜。

1.4.4大肠杆菌感受态细胞制备及DNA转化感受态细胞

1.4.4．1挑取TG1单菌落在LB培养基中37℃过夜培养；

1.4.4．2过夜培养的TG1菌按1：50或1：100稀释培养1.5-2hr;

1.4.4．3冰上冷却10min;

1.4.4．4 4000rpm × 3min, 4℃离心；

1.4.4．5沉淀用1ml 100mM CaCl2悬浮，冰上放置10min;

1.4.4．6 4000rpm × 3min, 4℃离心；

1.4.4．7沉淀用0.2ml 100mM CaCl2悬浮，冰上放置30min-24hr后使用;

1.4.4．8将连接产物与感受态细胞混合，冰上放置30min；

1.4.4．9于42℃热激90s后迅速放冰上2min;

1.4.4．10加入1ml LB(不含氨苄青霉素)，混合后于37℃保温1hr;

1.4.4．11在含100 g/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板(直径7cm)表面涂30 l x-gal (20mg/ml, 用二甲基甲酰胺配制)和3 l IPT G (200mg/ml), 然后涂布转化后的细菌;

1.4.4．12 37℃倒置培养10-14hr，待菌落长成后将平板置于4℃中保存。

1.4.5．大肠杆菌感受态细胞的快速制备及转化

1.4.5．1取1ml过夜培养的细菌, 置冰上10min, 离心收集细菌后加入100 l TSS悬浮, 置冰上10min后可用;

1.4.5．2加入要转化的DNA, 置冰上10min;

1.4.5．3 加入0.9ml 含20mM 葡萄糖的TSS, 37℃培养1小时即可涂板。

注：此感受态细胞可于－70℃保存4个月。

1.4.6农杆菌感受态细胞制备及冻融转化

1.4.6．1农杆菌稀释100倍过夜培养；

1.4.6．2吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；

1.4.6．3 5000rpm离心5min，弃去上清液；

1.4.7质粒提取――常规法

1.4.7．1取1ml细菌，12000rpm, 15s；

1.4.7．2用200 l Solution I重悬浮细菌，室温放置5min;

1.4.7．3 加入200 l Solution II，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；

1.4.7．4 加入200 l Solution III，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；

1.4.7．512000rpm, 10min;

1.4.7．6上清液移入新离心管，加等体积异丙醇, 颠倒混匀, 室温放置2min;

1.4.7．712000rpm, 5min，吸干残液；