受体配体结合研究

3.2.2 非选择性放射配基和选择性 非放射配基竞争结合

如果只有一种亚型受体系统，放射配基和选 择性非放射配基(抑制剂)与受体反应，则
Kd [ R][ L] [ RL]
Ki
[ R][ I ] [ RI ]
[ RT ] [ R] [ RL] [ RI ]

体系中[R]是共同的，解上述联立方程，得：

将(1)式重排变成下式：

[ RL] [ L] [ RT ] K d [ L]
（7）

设[RL] = ½[RT], [L]=[L]1/2, 带入上式，得
1 [ RT ] [ L]1 2 2 [ RT ] K d [ L]1 2


整理，得 Kd = [L]1/2 结论：在50％受体结合配基时,体系中游离配基 的浓度就是受体的解离平衡常数Kd值
3.1 单位点受体与配基结合反 应的数学表达

设：[RT]为受体的初始浓度
[ R] [ RT ] [ RL]

Kd
[ R][ L] {[ RT ] [ RL]}[ L] [ RL] [ RL]
（2）
重排并整理得：


（3） 上式即Scatchard方程 ，以[RL]/[L]为纵轴，以[RL] 为横轴作图得一直线 直线斜率为-1/Kd, 横轴截距为[RT], 纵轴截距为 [RT]/Kd
3.2.1选择性放射配基的饱和曲线


应该指出，即使[LT]很小时，低亲和力亚型也 不是完全不结合，所以不能把饱和曲线或 Scatchard 曲线截然分成两段，前一段是高亲 和力亚型结合，后一段是低亲和力亚型结合。 实际上每段曲线都是两种亚型结构的总和，只 是每种亚型所占比率多少不等而言 在实际分析数据工作中，首先需用合理的受体 结合反应的数学模型，然后是运用计算机程序 处理，才能得到两种亚型受体的[RT]和Kd值

k1 k2
[RL]
根据质量作用定律: v1 = k1[R][L], v2 = k2[RL] 复合物[RL]生成的速率为 （11） 设受体总浓度为[RT]，配基总浓度为[LT], 则
d [ RL] k1[ RT RL][ LT RL] k2 [ RL] dt d [ RL] k1[ RT RL][ LT ] k2 [ RL] dt d [ RL] k1[ R][ L] k2 [ RL] dt
[ RT ][ I ] [ RI ] Ki [ I ]


如果体系中有两种亚型受体，则
[ RT1 ][ I ] [ RT2 ][ I ] [ RI ] [ RI1 ] [ RI 2 ] K i1 [ I ] K i 2 [ I ] （9）
3.2.3 正负协同作用
构型异构体还是构象异构体？
Isotactic
Syndiotactic
构型异构体还是构象异构体？
Techniques in receptor research
尹长城 北京大学医学部生物物理学系
3. 受体与配基结合的动力学
3.1 受体放射配基结合分析


60年代初在受体研究中采用放射性标记核素 并建立了受体放射配基结合分析 (radioligand binding assay, RBA)，它的理论基础是占领学说 该理论认为
[ RL] [ RT ] [ RL] [ RT ] 1 [ RL] [ L] Kd Kd Kd
Scatchard图
3.1 单位点受体与配基结合反 应的数学表达

同理可推出：
（4） 上式为Woolf方程：以[L]/[RL]为纵轴，以[L] 为横轴作图得一直线 直线的斜率为1/[RT], 横轴截距为-1/Kd, 纵 轴截距为Kd/[RT]
3.2.4 反应速率常数的测定



测定受体-配基反应的速率常数是研究受 体反应动力学性质的一种研究方法 反应速率常数有结合速率常数k1 和解离 速率常数k2 反应达到平衡时其k2/k1 的值就是Kd ，即 平衡解离常数。用此法测得的Kd 值与饱 和实验所得的Kd值在理论上是一致的
结合速率常数
[R]+[L]
Kd 1 1 1 [ RL] [ RT ] [ RT ] [ L]



Lineweaver-Burk图百度文库
3.1 单位点受体与配基结合反 应的数学表达
设：[LT]是总配基浓度, [L] = [LT] – [RL], 将 [L] = [LT] – [RL] 和 [R] = [RT] – [RL]代入(2)式， 经整理得： 2 [ RL] [ RL]{[ RT ] [ LT ] K } [ RT ][ LT ] 0 （6） d



何谓正负协同作用？它是指当一部分受体与 配基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变 的现象 亲和力下降称之为负协同作用；亲和力增大 称之为正协同作用 在Scatchard图中，曲线斜率变小为负协同 作用；曲线斜率变大为正协同作用
Scatchard 图与正负协同作用
Hill方程与正负协同作用

用Hill作图法可判别协同作用的性质。其原理如 下： 倘若一个受体可以和n个配基结合，并且Kd 值相同, 则
k1 k2
[RL]


根据质量作用定律，结合反应速率为 v1= k1[R][L], 解离反应速率为 v2= k2[RL] 当反应达到平衡时, v1= v2，所以
k 2 [ R][ L] Kd k1 [ RL]

（1）

[R]、[L]、[RL]分别为游离受体、游离配基、受体-配基复 合物的摩尔浓度 k1、k2分别是结合速率常数、解离速率常数 Kd 是解离平衡常数，单位为mol/L; Kd 值的大小作为衡量 配基与受体相互结合能力的一个重要物理量: Kd值愈小结 合能力愈大; Kd又称为亲和常数
课程网址
http://e-learning.bjmu.edu.cn/bin/index.pl
构型(configuration)和 构象(conformation)



Configuration：The geometrical arrangement in polymers arising from the order of atoms determined by chemical bonds. Conformation：The geometrical arrangement in polymers arising from rotation about adjacent carbon-carbon single bonds. 构型的改变，分子中一定会有共价键的断裂和新的 共价键的生成；而构象的改变不需要共价键的变换

以
lg
[ RL] [ RT ] [ RL]
为纵坐标，lg[L]为横坐标作图：

直线的斜率为n，称为Hill系数
Hill系数与正负协同作用

令 lg
[ RL] 0, [ RT ] [ RL]
则 lg K d n lg[ L]1/ 2

由于kd值不变，如果：



n=1, [L]1/2 = Kd , 简单单位点系统 n<1, [L]1/2 > Kd , 体系中游离配基，受体亲 和力，负协同作用 n>1, [L]1/2 < Kd , 体系中游离配基，受体亲 和力，正协同作用



设 [LT]>>[RT],在反应过程中[LT]变化很小，则 （12）

结合速率常数

当反应达到平衡时，d[RL]/dt = 0，设此时复合 物的浓度为[RLe] ,则
d [ RL] k1[ RT RLe ][ LT ] k2 [ RLe ] 0 dt k [ RT RLe ][ LT ] k2 1 （13） [ RLe ]
3.2 双位点系统


一种配基可以和两种受体结合，这两种受体 往往是某类受体的两种亚型 选用某种放射配基，进行饱和实验， 用 Scatchard 作图法得到的不是直线而是向上 凹的曲线；这条曲线是由高低亲和性不同的 两条直线加合成的
双位点系统
饱和曲线
Scatchard曲线
双位点系统

近年来发展了很多方法用来进行双位点系统受 体亚型的研究



将（13）式带入（12）式，得
k1[ RT RLe ][ LT ] d [ RL] k1[ RT RL][ LT ] [ RL] dt [ RLe ]

整理，得
d [ RL] k [ LT ][ RT ] 1 dt [ RLe RL] [ RLe ]
{[ RT ] [ RL]}[ L]n Kd [ RL]
[ RL] [ L ]n [ RT ] [ RL] K d

移项，得

两边取对数，得
[ RL] [ L ]n lg lg lg K d n lg[ L] [ RT ] [ RL] Kd

（10）
Hill方程与正负协同作用

[ RL] [ RT1 ] [ RT2 ] [ L] K d 1 [ L] K d 2 [ L]
（8）

上式中[RL],[L]是实测值,[RL1]、[RL2]、Kd1 、Kd2 为四个待测 参数。只要有足够多的实验点，就可以用最小二乘回归法去 求四个参数，并根据参数再拟合成两种亚型的图形
Kd [ L] 1 [ L] [ RL] [ RT ] [ RT ]



Woolf图
3.1 单位点受体与配基结合反 应的数学表达

同理还可推出：
（5） 上式为Lineweaver-Burk方程，亦称双倒数 方程：以1/[RL]为纵轴，以1/[L]为横轴作图 得一直线 直线的斜率为Kd/[RT], 横轴截距为–1/Kd, 纵 轴截距为1/[RT]


受体与配基以单分子相互结合(分子比为1:1) 反应服从质量作用定律, 反应是可逆的 配基在结合和解离后不被代谢，也不与其它类型受体 结合 受体与配基结合后产生的生物效应的强度与受体被占 领的量成正比
3.1 单位点受体与配基结合反 应的数学表达

受体与配基结合作用的反应式如下:
[R]+[L]

上式为以[RL]为变量的双曲线一元二次方程 当[RT]、Kd固定时，[RL]随[LT]的变化而变化， 开始上升很快，以后逐渐趋向水平，这就是饱和 曲线
受体与配基结合曲线


SB为特异性结合，NSB为非特异性结合，TB为 总结合 [SB]= [TB] – [NSB]
3.1 单位点受体与配基结合反 应的数学表达

用选择性放射配基进行多点饱和实验 用非选择性放射配基和选择性非放射配基进行竞争 性取代实验

原则上它们也可以用于多种亚型的分析，但是 由于配基选择性的限制及实验误差的存在等原 因, 多数成功的例子仅限于双位点系统
3.2.1选择性放射配基的饱和曲线



选择性放射配基，对一种亚型有高亲和力, 而 对另一种亚型则为低亲和力 多点饱和实验显示，随着[LT]加大，[RL]先是 因高亲和力的大部分结合趋向饱和，然后由于 低亲和力亚型结合增多，曲线又住上翘 用Scatchard作图得到的不是直线而是向上凹 的曲线，也就是说，随着[LT]增加，曲线前部 分斜率很陡 (高亲和力亚型结合)，然后斜率平 坦 (低亲和力亚型结合)
3.2.2 非选择性放射配基和选择性 非放射配基竞争结合



选用放射配基对两种亚型受体的亲和力相同，选用 非放射配基对一种亚型有高的亲和力，对另一种亚 型则是低亲和力 在一定浓度的放射配基和受体系统中加入不同浓度 的选择性非放射配基作竞争结合反应。高亲和力的 配基容易与受体结合而取代放射配基，表现为部分 结合位点在低浓度竞争剂即明显丧失放射性，而另 一部分受体在高浓度竞争剂时对放射配基有明显抑 制作用 和双位点饱和曲线一样，这种区分不是绝对的。必 须通过计算机拟合才能得到两种亚型的各自参数
双位点饱和实验法

运用Scatchard方程分两种受体亚型，由于系统中放射配基L是 相同的, 它们各自的结合方程为
[ L][ RT1 ] [ RL1 ] K d 1 [ L]

[ L][ RT2 ] [ RL2 ] K d 2 [ L]
实际上，实验中测量得到的是[RL],而不是[RL1]和[RL2],由于 [RL]=[RL1]+[RL2],所以