菌种的保藏

（二）菌种衰退的原因

基因突变－－主要原因
1、有关基因发生负突变导致菌种衰退
2、表型延迟造成菌种衰退
3、质粒脱落导致菌种衰退

连续传代－－加速衰退 不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退
（三）菌种衰退的防止


控制传代次数
创造良好的培养条件


利用不易衰退的细胞移种传代
采用有效的菌种保藏方法
（三）砂土管保藏法
该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例 分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121℃蒸汽灭菌1～ 1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。将 待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线 菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后臵于干燥器 中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，臵 于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏。
（六）冷冻真空干燥保藏法
又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂 制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再 在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华 将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空 条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后臵于低温下， 使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。 此法适用于各大类微生物。
淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理（如药 物、低温、高温等），往往可以起到淘 汰已衰退个体而达到复壮的目的。
遗传育种法
把退化的菌种重新进行遗传育 种，从中再选出高产而不易退化的 稳定性较好的生产菌种。
第二节 菌种的保藏
菌种是重要的生物资源，研究和选择良 好的菌种保藏方法具有重要的意义。
一、菌种保藏的目的
（五）甘油悬液保藏法
此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，臵于低温下 保藏，本法较简便，但需臵备低温冰箱。保藏温 度若采用－20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用 －70℃，保藏期可达10年。 将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经 121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使 甘油的终浓度在10％～15％，再分装于 小离心管中，臵低温冰箱中保藏。 基因工程菌常采用本法保藏。
第八章 菌种的保藏
第一节 菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退 二、菌种的复壮 第二节 菌种的保藏 一、菌种保藏的目的 二、菌种保藏的原理 三、菌种保藏的方法
性状稳定的菌种是微生物工作最 重要的基本要求，否则生产或科研

都无法正常进行。

影响微生物菌种稳定性的因素：
a）变异；b）污染；c）死亡
第一节 菌种的衰退和复壮
（八）宿主保藏法
此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、 立克次氏体等）。 植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合， 冷冻或干燥保存。 噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基 混合直接保存。 动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器Байду номын сангаас体 液，然后分装于试管中密封，低温保存。
在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保 藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简 便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬 液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和 液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效 果最好。应用时，可根据实际需要选用。
尽可能多的采用不同的手段保藏 一些比较重要的微生物菌株
三、菌种保藏方法
各种微生物由于遗传特性不同， 因此适合采用的保藏方法也不一 样。一种良好的有效保藏方法， 首先应能保持原菌种的优良性状 长期不变，同时还须考虑方法的 通用性、操作的简便性和设备的 普及性。


一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的 微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的 细菌及酵母则不适用。

砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等 诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物 移接方便，经济简便。它的保藏期约1～10年。
（四）麸皮保藏法
又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然 后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水 以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经 冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将 试管臵于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干 燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔 封，再保藏，则效果更好。 此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏 期在1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较 多采用。
美国ATCC采用冷冻干燥保藏法和 液氮保藏法来保藏所有菌种。
我国CCCCM采用斜面低温保藏法、 冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进 行菌种保藏。
ATCC采用的两种保藏方法的优点示意图
优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点 是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期 短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污 染。
（二）石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体 石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物） 上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝， 加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内 保藏。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏 不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保 存1～2年左右。
菌种复壮的主要方法
纯种分离法
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体 中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离 出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性 状。
菌落纯（“菌种纯”）
细胞纯（“菌株纯”）
宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接 种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的 毒性。
在微生物的基础研究和应用研究中，选育 一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲 使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性， 便于长期使用，还需要做很多日常的工作。 实际上，由于各种各样的原因，要使菌种 永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜 在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规 律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种 的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。
讲究菌种选育技术
定期进行分离纯化

二、菌种的复壮

狭义的复壮－－消极的措施
是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯 种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已 衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有性状的相应措施。

广义的复壮－－积极的措施
是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰 退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性 状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个 体。
一、菌种的衰退
菌种衰退（degeneration）是指由于自 发突变的结果，而使某物种原有的一系列 生物学性状发生量变或质变的现象。
自发突变 不纯菌种 传代增殖
纯菌种
衰退菌种
突变个体
原始个体
（一）菌种衰退的现象

菌落和细胞形态改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 代谢产物生产能力下降，即出现负突变 致病菌对宿主侵染能力下降 对外界不良条件的抵抗能力下降等
斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法
（一）斜面低温保藏法－－常用保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，臵于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续不断。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏 此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6 个月左右。

菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持 其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死 亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、 交换和使用等诸方面的需要。
二、菌种保藏的原理
首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行 保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢 子、芽孢等。 其次应人为地创造环境条件（如：干 燥、低温和缺氧），使微生物长期处 于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休 眠状态。

此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有 保护剂，保藏期一般长达5～15年，存活率高， 变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想 保藏方法。
的

该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻 干机等设备。
（七）液氮超低温保藏法
简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等 作为保护剂，在液氮超低温（－196℃）下保藏的方法。 其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低 温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免 膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。 此法适用于各种微生物菌种的保藏。 此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保 藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有 效的菌种长期保藏技术之一。 此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种 培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购臵 超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用 较高。