里氏木霉高产纤维素酶菌株的选育及产酶培养基的优化

基金项目:公益性行业(农业)科研专项资助项目(编号:nyhyzx07-011-06)
作者简介:傅力(1964-),女,新疆农业大学食品科学学院副教授。

E 2m ai:l fl 1990@163.co m
收稿日期:2009-02-16
第25卷第3期2009年5
月Vol .25,No .3M ay.2009
里氏木霉高产纤维素酶菌株的选育及产酶培养基的优化
St udy on breedi ng and medi u m optim izati on of Trichoderma reese w ith hi gh cell u l ase acti vity 傅 力
1
FU Li
1
涂正东
2
TU Zhe ng 2dong 2
叶 凯
2
Y E Ka i
2
丁友昉
3
D ING Y ou 2fang
3
(1.新疆农业大学食品科学学院,新疆乌鲁木齐 830052;2.新疆农业科学研究院,新疆乌鲁木齐 830091;
3.天津科技大学生物工程学院,天津 300222)
(1.College o f F oo d Science ,X i njiang Agricult ura l Uni ver sity ,Uru m qi ,X i njiang 830052,Ch i na;
2.Xinjiang Acade my o f Agricult ura l S cience ,Uru m qi ,X i njiang 830091,China;
3.College of B iotec hnolo gy ,T ianjin Universit y o f S cience and Technolo gy ,Tianjin ,300222,China )
摘要:通过对里氏木霉D WC 原生质体紫外线诱变,筛选产纤
维素酶活力高的突变株并对该菌株的产酶培养基进行优化。

研究原生质体最佳诱变时间以筛选高产纤维素酶的突变株,同时分别对产酶培养基中不同种类碳源和氮源、Vogel .s 母液、表面活性剂对CMC 酶活(C MCA)、FP 酶活(FPA)的影响进行了研究。

结果表明:原生质体经过90s 诱变,得到产纤维素酶活力高的突变株D WC5,其C MCA 、FPA 分别达到410.2mg /mL #0.5h 和23.2m g/mL #h 分别为原菌株的1.5倍和1.2倍。

D WC5突变株的C MCA 、FPA 达到最高水平的培养基条件是:氮源N H 4C l0.2%、碳源微晶纤维素1%、Vo ge l .s 母液4.0%、吐温800.1%~0.15%、微量元素母液0.01%。

关键词:里氏木霉;纤维素酶;培养基;FP 酶活;CMC 酶活
A bs tract :The protop l asts of Tric hoder m a reeseiD WC was treated by UV rad i ati on f or ob t a i ning them utan tw i th h i gh cell u l ase activit y .Th e opti m al m ed i u m was st ud ied .The res u lts were as f oll o ws :The mu tantT ri chod er m a rees ei D WC5was obtai n ed f or 90s UV treat m ent .Th e e n z y m e acti vities of bot h C MC and FP of t h e mu tant D WC5reached 410.2m g /mL #0.5h 、123.2m g/mL #h respectivel y and t hey were 1.5ti m es and 1.2ti m es re 2spectivel y co mpari ng t o D WC ,res pecti vel y .The op ti m alm ed i um co m pos i 2ti on was n itroge n source NH 4Cl 0.2%,carbon s ource av i cel 1%,Vogel p s m ed i u m 4.0%,Tween 800.1%~0.15%,trace ele m entm i xt u re 0.01%.K eyword s :Trichoder m a reese ;Cell u l ase ;M ed i u m;C MCase acti vit y ;FPase acti v i ty
纤维素是地球上数量最大的可再生能源物质,每年全球光合作用的产物高达1.5@1011~2.0@1011t [1],中国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有20亿t [2]。

但由于其木质纤维素含量高,生物降解缓慢,目前对其利用率不高。

近年来对纤维素降解方面的研究最经济、环保的方法就是生物降解[3~5]。

利用微生物或其产生的纤维素酶可将纤维素酶解为低分子量的己糖或戊糖,用于生产新型饲料、单细胞蛋白等,将缓解人类面临的粮食、能源及环境危机[6]。

纤维素酶在食品工业中也有着重要而广泛的用途,广泛用于果蔬加工、油料作物加工、茶叶生产、酒精生产、啤酒生产、食醋酿造、活性物质提取等方面。

目前研究发现的能降解纤维素的微生物多为木霉、青霉、曲霉等真菌,它们普遍存在酶活力较低的问题[2]。

筛选高效纤维素分解菌是降解纤维素的关键之一,其中利用诱变手段进行筛选优良菌株是提高纤维素酶活的有效途径之一[7,8]。

本试验对里氏木霉(T richoderma reese i)D WC 进行紫外线诱变,选育产纤维素酶活力高的突变株,并对其高产纤维素酶培养基进行优化,为实际生产中利用纤维素酶提高纤维素的利用率提供依据。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
菌种:里氏木霉(Trichode r ma reese i)D W C :新疆农业大学微生物与发酵实验室保藏,其C M CA 、FPA 分别为273.5mg /mL #0.5h 和102.7m g/mL #h ;
10
培养基:纤维素斜面培养基[9]:Vo gel.s母液4%,微晶纤维素1%,微量元素母液0.01%[10],琼脂2%,吐温800.1%, p H5.1;
纤维素液体培养:纤维素斜面培养基中不加琼脂,另加0.1%消泡剂;
基本培养基:葡萄糖30g,NaN O
32g,K
2
HPO
4
1g,
FeS O
40.01g,KC l0.5g,M g SO
4
#7H
2
O0.5g,H
2
O1000mL,
p H6.6;
再生完全培养基:用0.6M蔗糖溶液代替H
2
O配制基本培养基;
溶液:醋酸缓冲液:NaAC#3H
2
O15.80g和HAC 4.92mL,用去离子水2000mL定容,调p H值至4.80?
0.05,最长贮存时间4周;
0.6M NaC l溶液:将35.1g NaC l溶解于0.2M Na
2HPO
4
溶液中,用0.2M Na H
2PO
4
调到p H5.8,定容至1L;
超净工作台:W-C J-ICU型,苏州净化有限公司;
恒温振荡箱:T H Z-98A型,上海)恒科技有限公司;
恒温培养箱:D H P)9162型,上海)恒科技有限公司;
台式低速离心机:TD5A)WS型,长沙湘仪离心仪器有限公司;
恒温水浴锅:HW S26型,上海)恒科技有限公司;
p H计:DEL TA320型,梅特勒)托利多仪器上海有限公司;
立式电热压力蒸汽灭菌器:LDZX-50KB,上海中安医疗器械厂;
光栅分光光度计:722型,上海精密科学仪器有限公司。

1.2方法
1.2.1D WC原生质体制备[11]制备方法见参考文献[11]。

1.2.2D WC原生质体紫外线(UV)诱变[12]用0.6M N aC l 溶液稀释原生质体至105个/mL,将原生质体5mL移入9c m 的无菌培养皿中,置于20W紫外灯下30c m处,边搅拌边照射,照射时间分别为30,60,90,120s。

照射后在红灯下分别将不同照射时间诱变处理的菌悬液稀释适当倍数,每个稀释倍数取0.1mL涂布于再生完全平板,用黑布包好。

同时用无菌水对原生质体稀释,取10-2,10-3,10-4稀释液各0.1mL,涂布于基本培养基平板,在30e下培养70h。

统计菌落数,计算原生质体经紫外线诱变后的再生率。

1.2.3高产菌株的筛选挑取完全再生平板上的单个菌落,接种于纤维素斜面培养基上,30e下培养7d,按1.2.4方法测酶活。

1.2.4纤维素酶活力测定方法[13]以羧甲基纤维素钠酶活(C MCase acti vity,简称C MCA)和滤纸酶活(FP ase acti vity 简称FPA)为测定指标,2种酶活力测定均采用3.5)二硝基水杨酸显色法。

(1)CMCA:在测定条件下1mL酶液30m i n酶解羧甲基纤维素钠产生1m g葡萄糖为一个单位。

用mg/mL#0.5h 表示。

(2)FPA:在测定条件下1mL酶液1h酶解滤纸产生1m g葡萄糖为一个单位。

用m g/mL#h表示。

1.2.5纤维素酶的发酵方法和酶液的制备将1环里氏木霉接种在纤维素固体斜面上,30e培养5~7d形成孢子后,用1mL无菌水将孢子洗下,得到菌悬液。

250mL三角瓶装纤维素液体培养基40mL,接入菌悬液1mL,30e,转速150r/m in摇床培养4d。

然后将2mL上述培养液再接入40mL纤维素液体培养基中,30e、150r/m in摇床培养7d。

发酵液经2000r/m i n,10m i n离心除去菌体及培养基残渣,上清液用醋酸缓冲液作适当稀释,测定C MCA和FPA。

1.2.6产酶培养基优化
(1)不同种类碳源对酶活力的影响:按照1.2.5方法,但在纤维素液体培养基中碳源分别采用微晶纤维素、纤维二糖、小麦杆、稻草杆和C MC,每种碳源用量均为1%。

(2)不同种类氮源试验:按照1.2.5方法,但在纤维素液体培养基中采用最佳碳源,氮源分别采用氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠、乙酸铵、草酸铵、磷酸氢二铵、柠檬酸铵、尿素为氮源,用量均为0.2%。

(3)Voge l.s母液加量试验:按照1.2.5方法,但在纤维素液体培养基中采用最佳碳源,氮源,Vo gel.s母液加量分别选择3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%。

(4)表面活性剂种类和添加量试验:按照1.2.5方法,但在纤维素液体培养中采用最佳碳源,氮源,Vo ge l.s母液,表面活性剂分别采用0.1%吐温80、0.1%Triton-100和0.1%SDS。

2结果与分析
2.1原生质体的UV照射时间
从图1可知,在120,150s照射条件下UV对原生质体致死作用加强,原生质体再生率下降较快。

因此,本试验选择UV照射时间30,60,90s
进行诱变处理。

图1照射时间对D WC原生质体再生率的影响
F i gure1E ffect of radiati on ti m e on ra te
regenerati on of protoplast
2.2高产菌株的筛选
从平板上挑出100株菌,通过发酵试验得到5株纤维素酶活力高的菌株如表1所示。

11
科研开发2009年第3期
表1 诱变后高产菌株的酶活Table 1 The enzy me acti viti es of mutants
菌株照射时间/s C MCA /
(mg #mL -1#0.5h -1)
FP A /(m g #mL -1#h -1)
D WC590410.2123.2D WC1490402.5107.1D WC3960397.797.3D WC4260393.996.9D WC21
30
376.0
106.1
UV 处理90s 筛选得到的D WC5活力最高,其C MCA 、
FPA 分别达到410.2m g/mL #0.5h 和123.2mg /mL #h ,分别分为原菌株的1.5倍和1.2倍。

故90s 为最佳照射时间,选定D W C5做为以下试验菌株。

2.3 产酶培养基的优化
由图2可知,以微晶纤维素为碳源,C MCA 最高为414.1mg /mL #0.5h ,其次是以C M C 为碳源,C M C A 为312.1mg /mL #0.5h ,再次以纤维二糖、小麦杆、稻草杆,C MCA 分别为221.7,221.4,220.3mg/mL #0.5h ,以乳糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖为碳源,C MCA 最低。

由于纤维素酶是诱导酶
[14]
,以纤维素原料为碳源其酶活较高,纤维素原料是
纤维素酶良好的诱导剂,以其它糖类为碳源虽能促进菌体的生长,但却抑制了酶的产生,必须在这些物质被耗尽后才有
纤维素酶产生。

图2 不同种类碳源对C MCA 及FPA 的影响F i gure 2 Effect of d ifferen t carban substrate
on C MCA and FPA
以微晶纤维素为碳源,FPA 最高为120m g/mL #h ,其次是以CMC 和麦芽糖为碳源,FPA 分别为68,54mg /mL #h ,再次为纤维二糖、小麦杆粉、稻草杆粉为碳源,FPA 分别为18,17,19mg /mL #h ,以乳糖、蔗糖葡萄糖为碳源,FPA 最低,所以1%微晶纤维素为最佳碳源。

2.4 不同种类氮源对酶活力的影响
由图3可知,氮源的种类对C MC A 和FPA 的影响相似,以氯化铵为氮源其C MC A 、FPA 最高,分别达425m g/mL #0.5h 和119m g/mL #h ,其次是硝酸铵,酶活分别达到171.6mg /mL #0.5h 和67m g/mL #h ,再次为硫酸铵,C M 2C A 、FPA 分别达到146.9mg /mL #0.5h 和65m g/mL #h 。

其余氮源2种酶活均较低。

所以0.2%氯化铵为最佳氮源。

图3 不同种类氮源对C MCA 及FPA 的影响F i gure 3 E ffec t of different n itro gen substrates
on C MCA and FPA
2.5 Voge l .s 母液浓度对酶活力的影响
由图4可知,Voge l .s 母液加量为4.0%时,C MCA 和FPA 均为最高,分别为410.7mg /mL #0.5h 和203m g/mL #h ;当Voge l .s 母液加量4.5%时,酶活分别达到328m g/mL #0.5h 和188mg /mL #h ;低于4.0%或高于4.5%时,菌体生长速度慢,导致产酶过低。

由此可以确定Vogel .s 母液最佳加量为4.0%。

图4 Voge l .s 母液添加量对C MCA 及FPA 的影响F ig u re 4 Effect ofVoge ls 'soluti on on C MCA and FPA 2.6 表面活性剂对酶活力的影响
试验发现在0.1%吐温80、0.1%T riton-100和0.1%SDS 中,只有吐温80对D WC5产酶有促进作用,而另外两个因素对产酶无明显作用。

这与孔显良[15]、庄桂[16]研究结果相似。

吐温80的作用在于增加了细胞壁的通透性和增加细胞内诱导物的含量使纤维素酶的释放增加[17]。

图5 吐温80添加量对C MCA 及FPA 的影响F i gure 5 E ffect of T ween 80on C MCA and FPA 12
第25卷第3期
傅 力等:里氏木霉高产纤维素酶菌株的选育及产酶培养基的优化
选择吐温80的添加量为:0.05%,0.1%,0.15%,0.2%。

由图5可知:吐温80添加量为0.15%时效果最好,其C MCA和FPA分别达到451.6mg/mL#0.5h和253mg/mL#h;低于或高于0.15%时,酶活均有所下降。

所以选择吐温80添加量为0.15%
3结论
(1)对D W C原生质体诱变时间采取90s,得到产纤维素酶活力高的突变株D WC5,其C MCA、FPA分别达到410.2mg/mL#0.5h、123.2m g/mL#1h,分为原菌株的1.5倍、1.2倍。

(2)D WC5突变株C MCA、FPA达到最高水平的培养基组成是:氮源NH
4
C l0.2%、碳源微晶纤维素1%、Vogel.s母液4.0%、微量元素母液0.01%、吐温800.15%。

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