蛋白系列常见问题及解决方法

蛋白免疫学系列常见问题及解决方法

ECL

1)、膜上无目的条带

a)、目的蛋白未表达：可更换细胞重新表达。

b)、蛋白质被降解：提取蛋白时必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，并且提取过程应在冰上操作。

c)、转膜过程出现失误。

d)、抗体或酶失活：选择在有效期内的试剂。

e)、抗体不能识别目的蛋白：确认该抗体是否适用于western。

2)、目的条带很弱

a)、蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成：可适当加大蛋白上样量。

b)、蛋白没有充分转移到膜上：转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。

c)、抗体效价不高，用量不足，孵育时间太短，或抗体反复使用保存不当而失活：可考虑更换效价更高的抗体，或提高抗体稀释度，延长抗体孵育时间；若怀疑抗体失活，可用斑点杂交实验确定抗体活性。

d)、曝光时间太短：可适当延长曝光时间。

3)、目的条带很浓

a)、可减少蛋白上样量。

b)、降低一抗二抗稀释度，减少抗体孵育时间。

c)、如果背景深的话，则要把发光液沥干些再压片；如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。

4)、有非特异性条带

a)、蛋白上样量过大：降低蛋白上样量。

b)、一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高：可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。

c)、洗膜不充分：可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer 中添加终浓度0.05%的Tween-20。

d)、目的蛋白在体内存在多种修饰形式，如乙酰化，甲基化，磷酸化，糖基化等：可查阅文献，用合适的方法去除蛋白的修饰，或选择合适的抗体。

e)、目的蛋白降解：重新准备蛋白样品，并加入足够的蛋白酶抑制剂。

5)、高背景

a)、膜没有均匀浸湿：转膜前应用100%甲醇将PVDF膜完全浸湿10秒，快速激活。

b)、膜或缓冲液污染：拿取膜与吸水纸时要戴手套，及时更换新鲜转膜缓冲液。

c)、封闭不充分：延长封闭时间。

d)、抗体与封闭剂出现交叉反应：检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应：如果有交叉反应，则需更换封闭液。

e)、抗体浓度过高：增加抗体稀释倍数。

6)、荧光淬灭

a)、抗原浓度太高：局部过多的HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可降低抗原上样量。

b)、抗原浓度太低，荧光信号太弱，可能第一次压片能够获得很弱的条带，再压片就没有什么条带都没有。

c)、操作时间过长，膜逐渐干掉：避免膜干掉。

d)、不良的实验习惯导致设备或试剂污染：例如铁锈和不慎沾染的显影液、定影液，会造成荧光淬灭，甚至直接导致无荧光。

7)、膜上出现单个或多个白点

a)、膜和胶块之间存在气泡：转膜时应赶尽膜和胶块之间的气泡。

8)、制备的凝胶不平

a)、胶板洗刷干净。

b)、加入AP和TEMED的量要合适；各组分加入后要充分混匀，防止部分胶块聚合不均匀；受热不均匀导致胶聚合不均匀。

9)、用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求

a)、一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。

10)、检测到的抗原分子量是资料上的两倍，是怎么回事

a)、抗原形成了二聚体：增多β-巯基乙醇的量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。

11)、做western必须要加内参吗

a)、内参起着校正总蛋白上样量的重要作用，只有在内参条带基本均匀一致的情况下，目的蛋白条带出现的差异才有意义，表明的确是实验设计的干预因素造成目的蛋白量的变化，而不是加样误差造成目的条带含量的变化.所以内参是必须做的。