几丁质脱乙酰酶产

结果与讨论

1 产几丁质脱乙酰基酶菌种初筛 经过富集培养和常规稀释涂布，初筛得到的186株能使平板变黄的菌， 从中挑选出8株变色较深的菌落保存至斜面培养基，结果如表2所示

2 脱乙酰度法复筛 平板变色较深的8株菌接种复筛发酵培养基，30℃，180r/min摇瓶培 养48h，发酵结束后测定脱乙酰度从8株菌中选取脱乙酰度较高的5株 菌，多次发酵筛选，确定其脱乙酰度的稳定性。30℃、180r/min摇床 培养48h，终止发酵后，脱乙酰度测定结果见表3
几丁质脱乙酰酶产生 菌的筛选
作者：刘丽1，赵祥颖2，刘建军1，2* （1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250012；2. 山东省食品发酵工程重点实验室，山东济南250013）
马文心 许丽娜 张静
文献的研究背景
几丁质（chitin）是自然界存在的天然多糖大分子，又 称甲壳素、甲壳质、壳蛋白，是由N-乙酰氨基葡萄糖通过 β-1，4糖苷键聚合而成的高分子直链化合物，广泛存在于 甲壳类动物虾、蟹的外壳中以及真菌、高等植物的细胞壁 中，在自然界中的储量仅次于纤维素。
由以上结果可知，经过显色平板初筛和脱 乙酰度法复筛，最终得到S-1、D-5、HL-6、 HL-7、D-9 5株脱乙酰能力较高的菌。对复 筛得到的5株菌接种产酶发酵培养基发酵， 测定其酶活值。 同等发酵条件下S-1具有较高的酶活，可以 确定S-1即为所要筛选的目的菌

讨论

本实验筛选得到8株对壳聚糖脱乙酰度较高 的细菌菌株，之后用对硝基苯乙酰胺为第 五测定8株菌发酵后的酶活值，最终确定菌 株S-1有较高的几丁质脱乙酰酶活力，菌株 S-1产酶培养基的最佳碳源为蔗糖，最佳氮 源为酵母膏，KH2PO4、MgSO4、CaCl2等 无机盐对S-1产酶具有促进作用，ZnSO4有 抑制作用，为进一步探究影响菌株产酶最 佳发酵条件及酶活性质奠定了基础

2.该实验室最先建立了显色平板和测定脱乙 酰度相结合的方法，筛选得到一株几丁质 脱乙酰酶活性较高的细菌菌株S-1，研究了 产几丁质脱乙酰酶细菌菌株S-1的筛选过程 和产酶条件。

3.几丁质乙酰化的方法主要有化学法和酶法，常 用的化学法污染严重且反应条件不易控制，产品 质量难以保证，而采用几丁质脱乙酰基酶（Chitin Deacetylation，缩写CDA，E.C.3.2.1.41）酶法 生产壳聚糖，不仅可解决污染问题，而且反应条 件温和、产品质量可以保证。目前国内外关于几 丁质脱乙酰酶产生菌的研究仅有少量的文献报道， 且得到的CDA产生菌多数为真菌（如毛霉、根霉 等）。因此筛选能产生该酶的菌具有重要的实用 价值和学术研究价值。
实验方法
1 菌种筛选 菌种初筛（显色平板法），取一定量的土样于30℃、180r/min摇床富 集培养2周，将富集后的上清液进行梯度稀释，涂布初筛平板培养基， 30℃恒温培养4d~7d，挑取周围呈现黄色的菌株，转接至斜面培养基。 菌株复筛（脱乙酰度法）[8-9]，将初筛得到的各菌株接种发酵培养基， 装液量35mL/250mL，30℃、180r/min培养48h，发酵结束后，滤纸 抽滤除去发酵液中的菌体，收集精确称量经干燥到恒重的壳聚糖，测 定其脱乙酰度。 2 脱乙酰度的测定 100mL三角瓶中，加入精确称量干燥到恒重的壳聚糖0.20g~0.24g， 20mL 0.1mol/L HCl标准溶液，指示剂1%甲基橙2~3滴，室温下磁力 搅拌器搅拌0.5h~1h至溶解，随后在搅拌条件下用标准0.1mol/L NaOH溶液滴定过量的HCl，当溶液由红色变为黄色即为滴定终点， 根据滴定终点时用去的NaOH的体积，用公式计算得到壳聚糖的脱乙 酰度值DD。同时做空白对照试验，同样条件下未接菌种的发酵培养 基中壳聚糖的脱乙酰度。
3.几丁质脱乙酰基酶活测定 比色管中加入50℃预保温的浓度为0.05mol/L的 Tris-HCl缓冲液（pH8.0）3mL、200mg/L的对硝 基乙酰苯胺溶液1mL、适当浓度的酶液1mL，于 50℃水浴反应15min，沸水浴终止酶促反应，用 蒸馏水定容至10mL，混匀，3000r/min离心 10min，测定上清液在波长400nm处的吸光度值 （A400）。空白对照体系中添加的为1mL相应浓 度的灭活酶液（沸水浴灭活），其余同上，测定 上清液的吸光度值（A0）。 CDA酶活单位的定义：在上述反应条件下每小时 产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶 活力单位，CDA酶活按公式计算
本研究文献的优点

1.本试验选用脱乙酰度较低的壳聚糖添加到筛选 培养基中，根据培养前后壳聚糖脱乙酰度的变化 即可判断该菌株是否具有分泌脱乙酰酶的能力， 比文献：《蒋霞云，周培根，李燕，等.几种霉菌 产甲壳素脱乙酰酶活力比较及部分酶学性质[J].上 海水产大学学报，2006，15（2）：211-215.》 和《黄惠莉，叶存印，姚云艳.枯草芽孢杆菌甲壳 素脱乙酰酶的筛选及酶学性质[J].微生物学通报， 2004，31（3）：33-37.》报道中单纯运用显色 平板的筛选方法相比，该方法选择性更强且大大 减小了筛选工作量，提高了筛选工作效率。
本文献研究的不足之处
数据可靠性不够充分： 碱量法测脱乙酰度时没有重复取平均值， 数据缺乏波动区间

本文献研究的不足之处

仰振球,李巧霞,樊红雷,宋宝珍. NMR、FTIR及电位滴定法测定壳聚糖 脱乙酰度[J]. 功能高分子学报, 2003,(03) . 中指出在采用酸碱滴定法测 定壳聚糖脱乙酰度的过程中 ，一方面，由于接近终点时碱的局部浓度 较高，会有壳聚糖沉淀析出，影响点击pH或电位的测定另一方面，壳 聚糖十大分子，其酸性溶液成胶体状态，在采用一般的（如甲基橙） 指示剂是，很难判断终点。 前者和赵颖,杨琰,卢实,张红菱. 壳聚糖脱乙酰度两种测定方法的比较 [J]. 武汉工业学院学报, 2009,(02) .实验中均指出线性电位滴定法比酸 碱指示剂法能更好地避免人为误差，具有较高的准确性和精密度，而 且操作简单。
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据查证，有多种脱乙酰基的酶，本实验中 缺乏酶的提纯 本小组认为，实验中脱乙酰酶的筛选和测 定采用壳聚糖，而题目命名为几丁质脱乙 酰酶，由于结构不同两者的脱乙酰酶活力 和种类也会不同，所以不够准确


几丁质分子中的糖残基部分脱去乙酰基就转变成壳聚糖
材料与方法

实验仪器及材料
1.仪器与试剂：PSH-2C精密型酸度计（上海伟业仪器厂），万分之一分析天平， 电子天平，循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），磁力搅拌器。 几丁质、壳聚糖（济南海得贝生物有限公司），新华滤纸，浓HCl（分析纯）， NaOH（分析纯），指示剂甲基橙，对硝基乙酰苯胺分析纯（分析纯），三 羟甲基氨基甲烷（Tris） 2.培养基 富集培养基：壳聚糖2.5g，K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，MgSO4 0.5g，NaCl 0.1g，pH值为7.2~7.5，定容至1L。 平板筛选培养基：胶体几丁质200g，K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，MgSO4 0.5g，NaCl 0.1g，对硝基-N-乙酰苯胺0.2g，琼脂20g，定容至1L。 复筛发酵培养基：壳聚糖7.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，NaNO3 2g，玉米 浆5g，定容至1L。 产酶发酵培养基：蛋白胨2.5g，蔗糖5g，（NH4） 2SO4 2.5g，KH2PO4 1g， K2HPO4 1g 乙酸钠3g，玉米浆5mL，定容至1L。 3.土样来源 浅海土样，埋有蟹壳的花园土样，腐败蝉蜕，虾蟹养殖场土样，湖水水样。