流式细胞术临床应用

流式细胞术的临床应用

一、在肿瘤学中的应用

这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。

1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断

人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。

2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用

FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。

3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用

研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚

期细胞可被Annexirr V和PI或7- AAD同时染色。多药耐药是肿瘤病人化疗失败的主要原因，FCM对多药耐药基因(MDR-1、P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定，可为临床治疗效果分析提供有力依据。

二、在临床细胞免疫中的作用

FCM提供了一种简捷地监测细胞亚群的方法。即通过荧光抗原和抗体检测技术对淋巴细胞膜表面分化抗原(CD分子)、细胞分类和各亚群进行分析，并计算出淋巴细胞各亚群的百分比，从而对人体细胞免疫状态进行评估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原发性和继发性免疫缺陷病、肿瘤的疗效观察和预后判断以及器官移植的监测上起着重要的指导作用。

如正常人群淋巴细胞CD3+CD4+/CD3+CD8+比值大约为2∶1，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用FCM还可以监测肾移植后病人的肾排斥反应，如果CD3+CD4+/CD3+CD8+比例倒置，病人预后良好，较少发生肾排异现象；反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于爱滋病的诊断和治疗中。

白细胞表面分化抗原的检测：

CD3+：T淋巴细胞；CD45RA：未受刺激（Naive）T淋巴细胞；CD45RO：记忆T淋巴细胞

CD3-CD19+：B淋巴细胞

CD3-CD16+56+：NK细胞

【NK细胞表达众多表面分子，如CD56、CD16、CD57、CD161等，但这些表面标志都不是NK细胞所特有的，只具有相对特异性。通常将CD56+、CD16+、CD3-、TCR-、BCR-的淋巴样细胞认为是NK细胞。以CD56+CD16+，CD56+CD16-和CD56-CD16+为标志将NK细胞分为3个亚群，发现CD56是NK细胞分化的特异性标志，而CD16的表达量与NK细胞的杀伤活性密切相关。在上述研究基础上许多学者主张以CD56的表达密度不同，将NK细胞分为CD56bright和CD56dim两群. CD56brightNK细胞高表达CD56, 低表达CD16, KIR(killer cell immunoglobulin-like receptors, KIR)；表达高亲和力的IL-2 受体。而CD56dim NK细胞高表达CD16，低表达CD56，仅表达中亲和力的IL-2受体。CD56bright NK细胞在IL-2的作用下表现出较强的增殖作用，而CD56dim NK细胞几乎不分泌细胞因子，且IL-2不能促其增殖。CD56dim NK细胞表现出较强的杀伤活性，而CD56bright NK细胞杀伤活性较低且表达一些末成熟标志，可以认为CD56bright NK细胞是未成熟的NK细胞，而CD56dim及NK细胞则相对较成熟，即NK细胞发育可能经历CD56bright NK细胞到CD56dim NK细胞这样一个过程。】

CD64：单核、巨噬细胞

CD1a、CD83：树突状细胞

CD3+CD4+CD8-：T辅助/诱导淋巴细胞标记（Th/Ti）；CD3+CD4+CD29+：T 辅助

淋巴细胞诱导亚群标记，辅助B淋巴细胞产生抗体和诱导细

胞介导的淋巴细胞溶解作用；CD3+CD4+CD45RA+：T抑制淋巴细

胞诱导亚群，诱导Th的活化和辅助其功能。T辅助细胞还可

分成Th1、Th2两个亚群，同时标记细胞内细胞因子IFN-γ

和IL-4，可区分Th1细胞（CD4+/ IFN-γ+）和Th2细胞

（CD4+/ IL-4+）。