第六章__微生物的生长繁殖与生存案例

相关定义
生长：微生物利用营养物质，细胞
物质的量增多，体积增大。
繁殖：微生物细胞体积增大到一定
程度时，细胞数目增多的过程。
研究微生物生长的方法
单个体微生物生长 生长 分批培养
群体微生物生长
连续培养
在污水生物处理中这两种方法均有应用。
分批培养概念：将定量的微生物接种到封
闭的具有定量培养基的容器中，保持一定的温 度、pH、DO，微生物进行生长繁殖,一定时间 后停止培养。
测定微生物总数：计数器直接计数；比 例计数法；比浊法 测定活细菌数：平板菌落法（CFU）计 数；液体稀释培养计数 计算生长量：测细胞干重法；通过测细 胞含氮量确定细胞浓度

四、微生物生长量 的测定方法
（一）测定微生物总数 1、计数器直接计数:用血球计数板（可 测细菌、酵母菌等）在显微镜下直接计数。 优点：能测定一定容积中细胞总数；简 单方便，测定速度快； 缺点：所测数目包括活菌和死菌，要求 检测人员较高技术，能分辨活、死菌。
2）恒化连续培养
恒化——进料营养物总量恒定 恒定的流速进水，恒定流速出水 尤其适合污水生物处理，除SBR法外；
lg细胞数（个/ml）
连续流入 新鲜培养 液
ห้องสมุดไป่ตู้单批培养
恒浊法 连续培养
恒化法
单批培养 时间
连续培养
目前,
污水连续生物处理法均 类似于恒化连续培养；（流速不 完全恒定）
恒浊培养
恒化 器
培养基 流速 （外控 制）
有限 制生 长因 子
恒定
低于最 高
实验 室为 主
微生物生长量的测定方法
微生物的生长量测定常用的方法有: 称重法、含N量测定法、DNA含量测定 法和 代谢活性法 。 而测定微生物数量变化常用的方法 有直接计数法、稀释平板计数法、最 大概率法 和 比浊法。
微生物生长量的测定方法
结果出现微生物数量由： 少 多（达到高峰后） 少
典型生长曲线
定量描述非丝状单细胞微生物分批 培养时,液体培养基中微生物群体生长 规律的经典曲线。 以时间为横坐标，细胞数目（或是对 数）或者细胞干重为纵坐标的曲线。
生长曲线的制作
生长曲线的制作： 接种 适温培养 定时取样测 定生长量
将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新 鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定 时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标， 以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲 线。
稳定期：新 繁殖的细胞数 目与衰亡的细 胞数目相等的 一段时期。
(3)静止期又称稳定期（stationary phase）
特点：
活细胞总数维持不变，即新繁殖的细胞 数与衰亡的细胞数相等，菌体总数达到最 高点；
细胞生理上处于衰老，代谢活力钝化， 细胞成分合成缓慢； 细胞生长速率为零。
营养物质被消耗不能满足生长需要 ，因此，营养物成为细菌生长的限制 因子；细菌开始累积贮存物质，如 PHB、淀粉粒等；
静止期微生物：
代谢活力比对数期差，但仍有相当的代谢活力，并 且微生物积累大量的贮存物，强化了生物吸附能力， 在二沉池中泥水分离效果好，出水水质好。
为什么延时曝气法处理低浓度废水时，不利
用静止期而用衰亡期的微生物？
由于低浓度有机物满足不了静止期
微生物的营养要求，处理效果不会好。 若采用延时曝气法，通常曝气时间在 8h以上，甚至24h，延长水力停留时间， 适当增大进水量，提高有机负荷，满 足微生物的营养要求，从而取得较好 的处理效果。
2 接种量。 1)接种量大，停滞期较短； 2)接种量小，停滞期较长。 3 培养基成分: 1)培养基成分丰富的，停滞期较短； 2) 培养基成分贫乏的 , 停滞期较长。 因为在丰富的培养基
上可直接利用各种成分，在贫乏环境中要产生新的酶类合成所 缺少的营养物质。
对数期：细 胞数以几何级 数增长的一段 时期。其时间 长短主要受菌 株种类、营养 成分和营养物 质浓度的影响。
3、染色图片计数
用0.01ml吸管吸取定量稀 释的细菌悬液均匀涂于刻有 1cm2的计数板上，经固定、 染色后、在显微镜下观察几 个视野并计数，取平均值。
每毫升原菌液的细菌数＝ 视野中的平均菌数×1 cm2/ 视野面积×100×稀释
血球计数板法
比浊法测定细菌悬液细胞数
原理：单细胞微生物的悬液与浊度成正比，与光密 度成反比。细胞数越多，浊度越大，透光度越小。因 此可用分光光度计测定菌悬液的透光度；或用浊度计 测菌悬液的浊度，即可测得该菌悬液的细胞浓度，将 未知细胞数的菌悬液和已知细胞数的菌悬液相比，可 求出未知菌悬液所含的细胞数。 测定前：将该菌悬液经10倍稀释法稀释成系列浓度 的菌悬液，分别取各稀释浓度的菌悬液1ml至于平皿 中，倒平板，培养和计数。然后以细菌数和光密度值 制作标准曲线，以便用比浊法测得光密度值后，可在 标准曲线上 求出相应得细菌数。
接种的培养基中细胞变化趋势

菌种接种于培养基中后，细胞需要适应新的 环境，因此细胞数目不增加；经过基础物质 的积累，且因营养物质丰富，所以细胞迅速 分裂，细胞数目急剧增加；细胞的繁殖导致 营养物质不断减少，某一种营养物质不足时， 有的细胞利用细胞内的累积物继续分裂，而 会有一部分细胞因营养不足而死亡，表现为 细胞数目不变；培养基中营养进一步匮乏， 细胞不断裂解，细胞数目减少。
影响衰亡期的因素
与菌种的遗传特性有关 : 有些细菌的培养经 历所有的各个生长时期，几天以后死亡,有些细 菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细 胞； 与营养物质和有毒物质有关：补充营养和能 源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞 的死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。
活性污泥中微生物生长规律和纯菌种基本一致、 SBR是分批培养的原理应用于污水生物处理的实例。
1.停滞期 停滞期特点 生长速率等于零
细胞合成新的成分
– 补充消耗的材料 – 适应新的培养基或别的培养条件 细胞形态变大或变长 对外界不良环境敏感
停滞期－“万事开头难”
特征： 不立即进行细胞分裂、增殖，数量不
变甚至减少
细 菌 数 目 的 对 数 值
为什么会出现停滞期呢？
停滞期
生长曲线在实际中的应用
总结
在污水生物处理设计时，按水质情况可利用 不同生长阶段的微生物处理污水：
常规活性污泥法：利用减速期、静止期；
生物吸附法：静止期；
高负荷活性污泥法：对数期和减速期； 延时曝气法(氧化沟)：内源呼吸期（衰亡期） 延时曝气法处理：针对有机物含量低，
BOD5/CODcr比值小于0.3，可生化性差的污 水；
生长曲线
生长曲线分期：细分可分为6个时 期即停滞期(适应期)、加速期、对数 期、减速期、静止期、衰亡期。 由于加速期和减速期持续时间很短， 则把加速期并到停滞期，把减速期放 到静止期中。故，将生长曲线粗分为 四个生长期。
延滞期：少 量细胞接种到 新培养基后的 一段细胞数目 不增加的适应 期。其长短主 要受微生物的 接种龄、接种 量和培养基成 分的影响。
2、电子计数器计数
原理：在一个小孔得两侧各放一个电极，通电 后，若有物体通过，电阻会发生改变。当细胞悬 液通过小孔时，每通过一个细胞，电阻就会增加 并产生一个信号，计数器就对该细胞自动计数一 次。 适用于较大的微生物如原生动物、藻类和非 丝状的酵母菌等； 优点：结构精确； 缺点：受微小颗粒和丝状物干扰大。
平板菌落计数法(CFU)
1ml 1ml
9ml 1ml 1ml
1ml
9ml
1ml
9ml 1ml 9ml
× 2
× 2
× 2
最常用的活菌计数法。 将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保 温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可 以计算出原菌液的含菌量。 直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50~500为 宜。按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数 原则，以平板菌落数在30~300之间为报告依据。
营养物的比例失调；有害物质的累积； pH、氧化还原势等物质条件越来越不 适宜。
衰亡期：细胞 死亡数目超过新 生的细胞数目的 时期。死亡的细 胞发生自溶。
4）衰亡期：继静止期后，由于营养物被 耗尽，细菌因缺乏营养而利用贮存物质进 行内源呼吸，即自身溶解。 特点：
细胞以指数速率死亡；死菌数大于新生 菌数； 细胞变形退化。
影响因素： 1）菌种；
2）营养成分（营养丰富则代时短,指数 期则短）

3）营养物浓度（概念：凡是处于较低 浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量 的营养物称为生长限制因子）


4）培养温度（适合温度）
世代时间
generation time 根据一定时间内细菌的增殖数量可以计算 出繁殖的代数（n），并以增殖时间除以繁 殖代数求得每繁殖一代所需的时间，称为 世代时间（G）
序批式活性污泥法
污水的可生化性
氧化沟
氧化沟
（二）连续培养
一方面连续进料，另一方面又连续出 料。 原理：进料=补足营养(“污染物”) 出料=稀释菌浓度、毒物浓度
它又分为两种： 1)恒浊连续培养 2)恒化连续培养。
1）恒浊连续培养
恒浊——培养基浊度恒定（实质是细菌数量 恒定） 以浊度为控制指标。 当浊度大时，加大进水流速，降低浊度； 当浊度小时，降低流速，提高浊度。
时间t
适应环境（合成相应 的酶），营养储备（用 于复制合成）
影响停滞期长短的因素 1.接种群体菌龄: 1)对数期“种子”，停滞期较短； 2)静止期期或衰亡期“种子”,停滞期较长；因
为处于静止期或衰亡期的细菌耗尽各种必要的细胞成分，需要 时间合成新细胞物质；或者因受到代谢产物过多积累而中毒， 需要时间修补损伤；
使用范围：用于生产大 量菌体、生产与菌体生长 相平行的某些代谢产物， 如氨基酸、乳酸、乙醇等。
恒浊器与恒化器的比较
装置 控制对 象 菌体密 度（内 控制） 培养 基 无限 制生 长因 子 培养 基流 速 不恒 定 生长速 率 最高 产物 应用 范围 生产 为主
恒浊 器
大量菌 体或与 菌体形 成相平 行的产 物 不同生 长速率 的菌体
第六章 微生物的生长繁 殖与生存因子
课程内容提纲
相关定义 第一节 微生物的生长繁殖 第二节 微生物的生存因子 第三节 其他不利环境因子对微生物影响 第四节 微生物与微生物之间的关系 第五节 菌种的衰退、复壮和保藏

第一节
微生物的生长繁殖
微生物的生长规律 微生物的连续培养 生长曲线在实际中的应用 微生物生长量的测定方法
液体稀释法
对样品做10倍连续稀释，从适宜的3个连续稀释度 中各取5ml试样，接种3组共9支装有培养液的试 管中（每管接入1ml）。经培养后，记录每个稀 释度出现生长的试管数，然后查 M.P.N.表（most probable number，最大可能数），根据样品稀释 倍数就可计算处其中的活菌含量。
（二）测定活细菌数
1、稀释培养计数：适用于生长较慢得
细菌；
2、过滤计数：适用于含菌量较少得水样，
将水样过0.45um滤膜，至于已倒好得平板上面培 养得到生长菌落，计数；大肠菌群通常用此法。
3、菌落计数：平板菌落（CFU）计数应
用最广泛，单位容量中的细菌均匀分布于营养琼 脂平板上而生长的菌落形成单位数
2.对数期
细菌获得丰富营养，生长速率最快，细胞呈对 数增长，分裂时间间隔最短；
由于营养物质足以供给合成细胞使用，有毒 的代谢产物累积较少，细菌生长速率恒定； 代谢旺盛，细胞成分平衡发展；
群体的生理特性较一致。
故教学实验中常用对数期细胞作为实验材料； 发酵工业一般用对数期细胞作菌种。
平 推 流 式 活 性 污 泥 法
衰老期
稳定期
占优势
对数期
进水
为什么常规活性污泥法不利用对数期而用静
止期微生物？ 对数期微生物：
生长繁殖快，代谢活力强，能大量去除废水中的有 机物，相应的，要求进水有机物浓度高。
由于进水有机物浓度高，出水有机物浓度也相应提 高，且这时期微生物生长繁殖旺盛，细胞表面黏液 层和夹膜尚未形成，运动活跃，不易自行凝聚成菌 胶团，沉淀性能差，导致出水水质差。
代谢废物或有害物质积累到抑制生 长水平； pH、氧化还原势等物化条件越来 越不适应
新生率等于死亡率。
在稳定期，细胞开始贮存糖原、异染
粒和脂肪等贮藏物，产芽孢，产次生代 谢产物。 可通过补料、调节pH、调整温度、流 出产物等措施以延长稳定期累积更多的 代谢产物。
出现的原因：生长限制因子的耗尽；