β-N-乙酰葡萄糖苷酶(NAG)检测试剂盒(PNP微板法)

β-N-乙酰葡萄糖苷酶检测试剂盒(PNP 微板法)

简介：

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)可水解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷，也能水解β-N-乙酰氨基半乳糖苷，该酶广泛存在于多种组织、体液、细胞，是溶酶体中的一种酸性水解酶，其测定方法有比色法和荧光光度法。

Leagene β-N-乙酰葡萄糖苷酶检测试剂盒(PNP 微板)(NAG Colorimetric Assay Kit)检测原理是在酸性条件下NAG 可使底物对硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷水解，释放出游离的对硝基酚(p -nitrophenol ，PNP)，在碱性条件下p -nitrophenol 呈黄色产物，产物黄色越深，说明β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性越高，反之则酶活性越低，通过酶标仪测定处吸光值，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中的β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：

自备材料：

1、 96孔板

2、 恒温箱

3、 酶标仪

操作步骤(仅供参考)：

1、 配制检测工作液：

① 配制显色工作液： 取出4-NAG ，恢复至室温后溶解于NAG Assay buffer ，混匀，

冰上预冷备用。新配制的显色工作液应在10天内用完。

② 配制标准品工作液：取出p -nitrophenol(10mM) 恢复至室温后，取溶解于ACP

Assay buffer ，使p -nitrophenol 达到。

编号 名称

TE0061 50T Storage

试剂(A): NAG Assay buffer 7.5ml 4℃ 试剂(B): 4-NAG 1支 -20℃ 避光 试剂(C): Alkaline buffer 0.05ml 4℃ 试剂(D): p -nitrophenol(10mM) 0.05ml -20℃ 避光 试剂(E): ddH 2O 1ml

RT 使用说明书

1份

2、 制备标准曲线：

① 按照下表稀释系列标准品溶液。

② 以试剂空白对照(以ddH 2O 代替标准液)调零，读取系列标准溶液的处吸光值即

A 401。该步骤可同待测样品一起操作。

③ 以每个浓度的标准品A 401为x 轴，以对应的p -nitrophenol 浓度为y 轴，用Excel

制作p -nitrophenol 浓度对A 401值的标准曲线。

3、 准备样品：

① 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离

心取上清，冻存，用于β-N-乙酰葡萄糖苷酶的检测。

② 血清和尿液样品：血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通

常也可以直接用于测定，冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。

③ 高活性样品：如果样品中含有较高活性的β-N-乙酰葡萄糖苷酶，可以使用原有的裂

解液或PBS 等进行稀释，也可以采用NAG Assay buffer 稀释。

4、 加样：按照下表设置96孔板样品空白对照、标准品、待测样品，溶液应按照顺序依次

加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行孔。 5、 按

照

上表每孔加入相应待测样品或标准品后，温育平衡。

6、 加入显色工作液，轻轻混匀，37℃孵育，加入Alkaline buffer 显色。

7、 用ddH 2O 调零，读取待测样品孔和空白调零孔的吸光度(即A 待测和A 空白)，如果无法

1 2 3 4 5 6 p -nitrophenol(3mM)(μl)

0.5 1 1.5 2 2.5 3 ddH 2O(μl)

9.5 9 8.5 8 7.5 7 相当于NAG 单位(U/L)

10

20

30

40

50

60

样品空白对

照孔 标准品孔

待测样品孔

待测样品 — 8μl ddH 2O 8μl

—

—

37℃温育平衡3min 。

显色工作液(37℃提前温育)

50μl

50μl

50μl

37℃孵育15～20min 。

Alkaline buffer 160μl 160μl 160μl 标准品工作液

—

8μl

—

检测，亦可检测吸光度，一般应数小时内检测完毕。A待测-A空白的差值为实际的吸光度，用该差值与标准曲线进行对比。

计算结果：β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性单位的定义：1L样品与底物在37℃条件下，每分钟水解4-NAG显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的β-N-乙酰葡萄糖苷酶的量定义为一个酶活力单位(1U/L)。根据酶活性定义，计算出样品中的β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性。

注意事项：

1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。

3、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检

测体积，尽量采用小体积的比色杯。

4、用窄带宽分光光度计，吸光度至1.0或酶活性达90U/L时仍为直线；用用窄带宽分光

光度计，吸光度至0.6或酶活性达60U/L时仍为直线。超出此范围应用生理盐水稀释样品后重新测定，结果乘以稀释倍数。

5、一支显色工作液配制后需当日使用完毕，因此请注意适当多准备一些样品一起检测。

6、尿β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性以肌酐比值“NAG(U/gCr)”计算酶排出率，这样既不因

为尿浓缩或稀释的影响而改变，又可不需留24h尿

7、p-nitrophenol溶液对人体有害，反应终止液有腐蚀性，请小心操作。

8、如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时应精确计时，此时推荐采用孵育30min

或更长时间，以减小操作过程中的时间误差。

9、待测样品中酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至30min。

有效期：12个月有效。

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