DNA琼脂糖凝胶电泳分析
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3 、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不 要刺穿凝胶；
4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境， 胶勿乱扔；
5 、紫外线照射不要太久。
3. 加样
• 将DNA样品（5ul）与6 × 上样缓冲液（1ul） 混匀后， 用微量加样枪小心加入样 品孔内。
– 注意加样枪的枪头不可插入 过深，以免刺穿凝胶，导致 样品外溢。
• 每加完一个样品要更换枪 头，以防止EB污染。
4. 电泳
• 接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切 记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的 一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极 之间的距离计算）
琼脂糖凝胶
• 天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻 粉
• 从石花菜及其它红藻类植物提取出来 的一种线状高聚物。
琼脂糖（agarose）
琼 脂
琼脂胶（agaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的 标准方法。
• 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，
停止电泳
5. 结果观察
• 电泳结束后，将凝胶板取出。 在紫外仪上观察电泳带及其位 置，记录实验结果。
注意事项
1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否 则温度太高会使制板变形；
2、 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖 直向上，不要弄坏点样孔；
实验操作
• 制备琼脂凝胶 • 胶板的制备 • 加样 • 电泳 • 紫外透射仪检测
操作步骤
1. 准备
用蒸馏水将电 泳槽和梳子 冲洗干净， 放在水平桌 面上，并架 好梳子
2. 配制1%琼脂糖凝胶及倒胶
具体步骤： • 三角瓶内：0.6g琼脂糖 +60ml(0.5×TBE) • 煮胶溶解 • 冷却至60℃(不烫手) • 加EB • 倒板 • 室温下充分凝固 • 垂直向上拔出梳子 • 将胶板放入电泳槽 • 向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面1~2nm。
• 样品： DNA分子量标准品，质粒 • 试剂
– 琼脂糖 – 1×电泳缓冲液（TBE） – 6×上样缓冲液 – 溴化乙锭(EB) ：10mg/ml
上样缓冲液
• 0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青；30％甘 油水溶液
• 作用： – ①增加样品密度，使其比重增加，以 确保DNA均匀沉入加样孔内 – ②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置 – ③使样品呈色，使加样操作更方便
– 银染色
影响琼脂糖凝胶电泳的因素
• DNA分子的大小：实验证明， DNA片段迁移距离与其分子量 的对数成反比；
• 琼脂糖的浓度：一定大小的 DNA片段在不同浓度的琼脂凝 胶中，电泳迁移率不相同；
• DNA分子的构型：不同构型的 DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速 度差别较大
琼脂糖凝胶的优点
(1) 操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理 就可进行电泳。
– 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外 线激发下，发出桔红色荧光
– 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳 后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min
– EB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或 更少的DNA即可检出。
（注意：EB被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配置和 使用EB时都应带上手套，且注意不要把EB洒到桌面或地板上。 ）
后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
• 银染色
– 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形 成稳定的复合物，然后用还原剂如甲 醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳 带染成黑褐色。
– 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色， 也用于琼脂糖凝胶染色。
– 灵敏度比EB高200倍，但银染色后， DNA不宜回收
• 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法 （如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
• 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶 (Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少 可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定 DNA片段在凝胶中的位置。
• 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA条带,用于以后的克隆操作。
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
主讲人：文琪 同组人员：黄梦秋 张如骐 肖重科
1
实验目的
• 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原 理和方法。
实验原理
• DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为 分子筛效应。
• 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解 离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
电泳指示剂：
• 核酸电泳常用的指示剂有两种 – 溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）； – 二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它携 带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁 移率比溴酚蓝慢
核酸电泳的染色剂
• 最常用的染色剂
– 溴化乙锭（ethidium bromide，EB）
• 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下， 使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而 达到分离核酸片段检测其大小的目的。
• 核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核 酸片段所在的位置。
实验器材和试剂
• 实验器材： – 桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透 射仪
(2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此 电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直 接用紫外监测及定量分析。
(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测 定。制成干膜可长期保存。
缺点：
1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳
4、EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境， 胶勿乱扔；
5 、紫外线照射不要太久。
3. 加样
• 将DNA样品（5ul）与6 × 上样缓冲液（1ul） 混匀后， 用微量加样枪小心加入样 品孔内。
– 注意加样枪的枪头不可插入 过深，以免刺穿凝胶，导致 样品外溢。
• 每加完一个样品要更换枪 头，以防止EB污染。
4. 电泳
• 接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切 记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的 一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极 之间的距离计算）
琼脂糖凝胶
• 天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻 粉
• 从石花菜及其它红藻类植物提取出来 的一种线状高聚物。
琼脂糖（agarose）
琼 脂
琼脂胶（agaropectin）:含硫酸根和羧基的强酸
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象。
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的 标准方法。
• 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，
停止电泳
5. 结果观察
• 电泳结束后，将凝胶板取出。 在紫外仪上观察电泳带及其位 置，记录实验结果。
注意事项
1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否 则温度太高会使制板变形；
2、 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖 直向上，不要弄坏点样孔；
实验操作
• 制备琼脂凝胶 • 胶板的制备 • 加样 • 电泳 • 紫外透射仪检测
操作步骤
1. 准备
用蒸馏水将电 泳槽和梳子 冲洗干净， 放在水平桌 面上，并架 好梳子
2. 配制1%琼脂糖凝胶及倒胶
具体步骤： • 三角瓶内：0.6g琼脂糖 +60ml(0.5×TBE) • 煮胶溶解 • 冷却至60℃(不烫手) • 加EB • 倒板 • 室温下充分凝固 • 垂直向上拔出梳子 • 将胶板放入电泳槽 • 向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面1~2nm。
• 样品： DNA分子量标准品，质粒 • 试剂
– 琼脂糖 – 1×电泳缓冲液（TBE） – 6×上样缓冲液 – 溴化乙锭(EB) ：10mg/ml
上样缓冲液
• 0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青；30％甘 油水溶液
• 作用： – ①增加样品密度，使其比重增加，以 确保DNA均匀沉入加样孔内 – ②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置 – ③使样品呈色，使加样操作更方便
– 银染色
影响琼脂糖凝胶电泳的因素
• DNA分子的大小：实验证明， DNA片段迁移距离与其分子量 的对数成反比；
• 琼脂糖的浓度：一定大小的 DNA片段在不同浓度的琼脂凝 胶中，电泳迁移率不相同；
• DNA分子的构型：不同构型的 DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速 度差别较大
琼脂糖凝胶的优点
(1) 操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理 就可进行电泳。
– 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外 线激发下，发出桔红色荧光
– 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳 后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min
– EB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或 更少的DNA即可检出。
（注意：EB被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配置和 使用EB时都应带上手套，且注意不要把EB洒到桌面或地板上。 ）
后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
• 银染色
– 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形 成稳定的复合物，然后用还原剂如甲 醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳 带染成黑褐色。
– 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色， 也用于琼脂糖凝胶染色。
– 灵敏度比EB高200倍，但银染色后， DNA不宜回收
• 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法 （如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
• 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶 (Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少 可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定 DNA片段在凝胶中的位置。
• 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA条带,用于以后的克隆操作。
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
主讲人：文琪 同组人员：黄梦秋 张如骐 肖重科
1
实验目的
• 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原 理和方法。
实验原理
• DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为 分子筛效应。
• 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解 离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
电泳指示剂：
• 核酸电泳常用的指示剂有两种 – 溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）； – 二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它携 带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁 移率比溴酚蓝慢
核酸电泳的染色剂
• 最常用的染色剂
– 溴化乙锭（ethidium bromide，EB）
• 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下， 使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而 达到分离核酸片段检测其大小的目的。
• 核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核 酸片段所在的位置。
实验器材和试剂
• 实验器材： – 桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透 射仪
(2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此 电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直 接用紫外监测及定量分析。
(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测 定。制成干膜可长期保存。
缺点：
1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳