细菌检测方法研究进展
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VNTR是近年提出的概念，因其在基因组中分布极为丰富， 故应用日趋广泛。就某一VNTR而言，通常重复单元可以 表现出几次到几十次不同的重复，并由此决定不同的长度 类型，因而其蕴含的多态信息量(PIC)较大。
3 细菌分子生物学检测技术
3.6 VNTR检测技术
例：单核细胞增生性李斯特菌检测分型
3 细菌分子生物学检测技术
2 细菌免疫学检测方法
2.4 酶联免疫吸附试验
应用酶联免疫技术制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪，是 用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标 生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗， 通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优 点是检测灵敏度高，速度快，可以在48小时的时间内快速 检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核李斯特菌，空肠 弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。
细菌检测方法研究进展
Contents
1
ຫໍສະໝຸດ Baidu
细菌传统检测方法
2
细菌免疫学检测方法
3 细菌分子生物学检测技术
4
展望
随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化 学、分子生物学的不断发展，新的细菌检测技术和方法 已广泛用于病原微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养 及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的检测 以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已 创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌 学检测方法，尤其分子检测技术的发展和应用，明显提 高了细菌的检测水平。
3 细菌分子生物学检测技术
3.5 DiversiLab系统
例 ：DivcrsiLab系统对医院感染的鲍曼不动杆菌进行同源性分析
3 细菌分子生物学检测技术
3.6 VNTR检测技术
可变数串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeat, VNTR) 通 常 由 二 个 核 甘 酸 组 成 的 单 元 如 “ 胞 嘧 啶 + 腺 嘌 呤”(CA)经过若干次重复组成，由于重复的次数(即n值)是 可变的，因而构成一种多态类型。
3.6 VNTR检测技术
例：单核细胞增生性李斯特菌检测分型
3 细菌分子生物学检测技术
3.7 焦磷酸测序技术 在细菌鉴定分型的分子生物学方法中，能够提供
核酸碱基序列资料的分子检测技术成为细菌鉴定 分型的金标准。
焦磷酸测序技术是一种准确、快速、实时进行短 片段DNA序列分析的方法，是一种依靠生物发光 进行DNA序列分析的技术。
3 细菌分子生物学检测技术
3.7 焦磷酸测序技术 例：焦磷酸测序技术检测沙门氏菌
4 展望
病原微生物的自动化系统 病原微生物的高通量检测技术是近年发展起来
的前沿技术，在病原微生物的检测分型和预防控 制领域具有十分重要的应用价值。由于其所需样 品和剂量较少、快速省时、检测结果精确、自动 化操作程度较高，适宜用于食源性病原微生物的 检测与分型。
4 展望
病原微生物的自动化系统
目前，最有代表性的是AMS微生物自动分析系 统。该套系统含有14种检测卡片，每一种鉴定卡 片有25种以上的生化反应指标。操作时，先将一 定浓度的欲鉴定菌株菌悬液接种到各种细菌的小 卡上。仪器会自动检测最后由计算机判定，打印 出鉴定结果。
该技术在细菌的检测分型和预防控制领域具有 十分重要的应用价值。
3 细菌分子生物学检测技术
3.3 DNA环介导恒温核酸扩增法
DNA环介导恒温核酸扩增法(LAMP)是一种连续、恒温、 基于酶反应的，可用于细菌和病毒的定性检测的新型核酸 扩增方法，具有高特异性和等温快速扩增的特点。
例：志贺菌检测
3 细菌分子生物学检测技术
3.4 CRISPR检测
近来研究发现成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRISPR)广泛分 布于细菌和古细菌中。
2 细菌免疫学检测方法
2.3 纳米免疫磁珠技术 纳米免疫磁珠技术是以抗体包被纳米磁珠的为载
体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合。本 方法最大程度地提高该致病菌的检出率及灵敏度， 在24h能够检出病原菌。
2 细菌免疫学检测方法
2.4 酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验(ELISA)是根据抗原或抗体特异 性免疫反应原理设计，将己知的抗原或抗体结合 在某种固相载体上，以辣根过氧化酶(HRP)为指示 剂，标记在另一种抗原或抗体上，加入酶作用底 物，酶与底物发生反应后，底物显色，根据底物 显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗 原。
1 细菌传统培养检测方法
1.3 API生化鉴定系统
主要依据API试剂条的生化反应结果将一种/组细 菌与其它细菌相鉴别，并用%id(鉴定百分率)表示 每种细菌的可能。各类API试剂条均由多个生化反 应组成，编码即是将生化反应谱转换成数码谱，以 便于使用生化反应检索手册或API电脑分析软件进 行检索，确定生化反应谱对应的是什么细菌。
3 细菌分子生物学检测技术
3.2 PCR检测技术
聚合酶链反应(PCR)是一种体外扩增DNA技术。当存在模 板DNA、底物、上下游引物和耐热DNA聚合酶时，经过 多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程，模板DNA就可 得到大量扩增。
3 细菌分子生物学检测技术
3.2 PCR检测技术
实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学 物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方 法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进 行定量分析的方法。
3 细菌分子生物学检测技术
3.4 CRISPR检测
例：志贺菌CRISPR的检测
3 细菌分子生物学检测技术
3.5 DiversiLab系统
DiversiLab系统是基于重复序列聚合酶链反应(repPCR)技术原理的半自动基因分型方法，通过PCR 扩增细菌基因组的非编码重复序列后根据扩增片 段的多态性比较菌株间相似性，其操作简单、可 重复、数据标准化，可广泛应用于医院感染菌的 快速检测分型。
2 细菌免疫学检测方法
2.6 免疫印迹法（Western blot)
免疫印迹法又称为蛋白质印迹法，是根据抗原抗 体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法。 它综合了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 的高分辨率及ELISA的高敏感性和高特异性，是 一种有效的分析手段，广泛应用于细菌的检测中， 但该方法操作复杂，耗时费力。
2 细菌免疫学检测方法
2.6 免疫印迹法（Western blot)
3 细菌分子生物学检测技术
3.1 核酸探针检测技术 根据完成杂交反应所处介质的不同，分成固相杂
交反应和液相杂交反应。
固相杂交反应是在固相支持物上完成的杂交反应， 如常见的印迹法和菌落杂交法。
液相杂交法指杂交反应在液相中完成，不需固相 支持，优点是杂交速度比固相杂交反应速度快。 缺点是为消除背景干扰必需进行分离以除去加入 反应体系中的干扰剂。
1 细菌传统培养检测方法
1.3 API生化鉴定系统 API（Analytic Products INC）系统用于细菌鉴定的
品种有15种，分别有相应的数据库。数据库由细菌 条目(taxa)组成，每个条目可能因情况的不同代表 细菌种、细菌的生物型、细菌的菌属。
2 细菌免疫学检测方法
2.1 免疫胶体金技术
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体 金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记 技术。
2 细菌免疫学检测方法
2.2 免疫层析技术
免疫层析技术一种将免疫技术和色谱层析技术相 结合的快速免疫分析方法。原理是将特异的抗体 先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的 硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由 于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移 动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即 与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免 疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现 特异性的免疫检测。
2 细菌免疫学检测方法
2.5 乳胶凝集实验（LAT)
LAT是以乳胶颗粒作为载体的一种间接的凝集试 验。利用人工大分子乳胶颗粒抗体，吸附可溶性 抗原于其表面发生肉眼可见的凝集反应，以达到 检测目标细菌的目的。乳胶凝集试验由于具有快 速敏感、简单易行、无需昂贵仪器等优点，已广 泛用于多种病原菌的检测以及流行病学调查中。
CRISPR主要由重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)间隔排列 构成的R-S结构组成，其与CRISPR相关蛋白基因(CRIPSPR
associated，cas)组成CRISPR /cas系统，为原核生物提供对
噬菌体、质粒等外源基因的获得性免疫能力，从而抵抗噬 菌体感染，限制基因的水平转移(HGT)。
与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的 新型培养基。 它是一种新型分离培养基，利用显色培养基进行 微生物的筛选分离，其反应的灵敏度和特异性大 大优于传统培养基。
1 细菌传统培养检测方法
1.2 显色培养基快速检测技术
例：大肠杆菌/大肠菌群显色培养基：用于食品、水、牛 奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测。 大肠杆菌显蓝色至紫色，大肠菌群显红色。
1 细菌传统培养检测方法
1.1 分离培养检测及鉴定方法 食品中病原菌的传统检测方法是将分离培养后的
可疑菌落做涂片染色实验、生化反应实验、溶血 实验、协同溶血实验（CAMP）、动物实验及典型 运动等鉴定等。
1 细菌传统培养检测方法
1.2 显色培养基快速检测技术 显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶
Ct值（Cycle threshold，循环阈值） 的含义为：每个反应管内的荧光信号到 达设定阈值时所经历的循环数
3 细菌分子生物学检测技术
3.3 DNA环介导恒温核酸扩增法
原理：针对靶基因的特定区域设计1种特异的引物， 利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymcrasc) 在65℃左右恒温保存几十分钟，即可完成核酸扩 增反应，且1h内可扩增靶基因至1010倍。反应过程 不会受到反应混合物的影响且受非靶序列DNA分 子的影响较小。同时，在等温条件下扩增，不会 因温度的改变而造成时间损失，并且模板也不需 要进行热变性，从而保证了LAMP扩增的高效特异 性。
3 细菌分子生物学检测技术
3.6 VNTR检测技术
例：单核细胞增生性李斯特菌检测分型
3 细菌分子生物学检测技术
2 细菌免疫学检测方法
2.4 酶联免疫吸附试验
应用酶联免疫技术制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪，是 用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标 生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗， 通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优 点是检测灵敏度高，速度快，可以在48小时的时间内快速 检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核李斯特菌，空肠 弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。
细菌检测方法研究进展
Contents
1
ຫໍສະໝຸດ Baidu
细菌传统检测方法
2
细菌免疫学检测方法
3 细菌分子生物学检测技术
4
展望
随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化 学、分子生物学的不断发展，新的细菌检测技术和方法 已广泛用于病原微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养 及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的检测 以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已 创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌 学检测方法，尤其分子检测技术的发展和应用，明显提 高了细菌的检测水平。
3 细菌分子生物学检测技术
3.5 DiversiLab系统
例 ：DivcrsiLab系统对医院感染的鲍曼不动杆菌进行同源性分析
3 细菌分子生物学检测技术
3.6 VNTR检测技术
可变数串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeat, VNTR) 通 常 由 二 个 核 甘 酸 组 成 的 单 元 如 “ 胞 嘧 啶 + 腺 嘌 呤”(CA)经过若干次重复组成，由于重复的次数(即n值)是 可变的，因而构成一种多态类型。
3.6 VNTR检测技术
例：单核细胞增生性李斯特菌检测分型
3 细菌分子生物学检测技术
3.7 焦磷酸测序技术 在细菌鉴定分型的分子生物学方法中，能够提供
核酸碱基序列资料的分子检测技术成为细菌鉴定 分型的金标准。
焦磷酸测序技术是一种准确、快速、实时进行短 片段DNA序列分析的方法，是一种依靠生物发光 进行DNA序列分析的技术。
3 细菌分子生物学检测技术
3.7 焦磷酸测序技术 例：焦磷酸测序技术检测沙门氏菌
4 展望
病原微生物的自动化系统 病原微生物的高通量检测技术是近年发展起来
的前沿技术，在病原微生物的检测分型和预防控 制领域具有十分重要的应用价值。由于其所需样 品和剂量较少、快速省时、检测结果精确、自动 化操作程度较高，适宜用于食源性病原微生物的 检测与分型。
4 展望
病原微生物的自动化系统
目前，最有代表性的是AMS微生物自动分析系 统。该套系统含有14种检测卡片，每一种鉴定卡 片有25种以上的生化反应指标。操作时，先将一 定浓度的欲鉴定菌株菌悬液接种到各种细菌的小 卡上。仪器会自动检测最后由计算机判定，打印 出鉴定结果。
该技术在细菌的检测分型和预防控制领域具有 十分重要的应用价值。
3 细菌分子生物学检测技术
3.3 DNA环介导恒温核酸扩增法
DNA环介导恒温核酸扩增法(LAMP)是一种连续、恒温、 基于酶反应的，可用于细菌和病毒的定性检测的新型核酸 扩增方法，具有高特异性和等温快速扩增的特点。
例：志贺菌检测
3 细菌分子生物学检测技术
3.4 CRISPR检测
近来研究发现成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRISPR)广泛分 布于细菌和古细菌中。
2 细菌免疫学检测方法
2.3 纳米免疫磁珠技术 纳米免疫磁珠技术是以抗体包被纳米磁珠的为载
体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合。本 方法最大程度地提高该致病菌的检出率及灵敏度， 在24h能够检出病原菌。
2 细菌免疫学检测方法
2.4 酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验(ELISA)是根据抗原或抗体特异 性免疫反应原理设计，将己知的抗原或抗体结合 在某种固相载体上，以辣根过氧化酶(HRP)为指示 剂，标记在另一种抗原或抗体上，加入酶作用底 物，酶与底物发生反应后，底物显色，根据底物 显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗 原。
1 细菌传统培养检测方法
1.3 API生化鉴定系统
主要依据API试剂条的生化反应结果将一种/组细 菌与其它细菌相鉴别，并用%id(鉴定百分率)表示 每种细菌的可能。各类API试剂条均由多个生化反 应组成，编码即是将生化反应谱转换成数码谱，以 便于使用生化反应检索手册或API电脑分析软件进 行检索，确定生化反应谱对应的是什么细菌。
3 细菌分子生物学检测技术
3.2 PCR检测技术
聚合酶链反应(PCR)是一种体外扩增DNA技术。当存在模 板DNA、底物、上下游引物和耐热DNA聚合酶时，经过 多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程，模板DNA就可 得到大量扩增。
3 细菌分子生物学检测技术
3.2 PCR检测技术
实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学 物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方 法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进 行定量分析的方法。
3 细菌分子生物学检测技术
3.4 CRISPR检测
例：志贺菌CRISPR的检测
3 细菌分子生物学检测技术
3.5 DiversiLab系统
DiversiLab系统是基于重复序列聚合酶链反应(repPCR)技术原理的半自动基因分型方法，通过PCR 扩增细菌基因组的非编码重复序列后根据扩增片 段的多态性比较菌株间相似性，其操作简单、可 重复、数据标准化，可广泛应用于医院感染菌的 快速检测分型。
2 细菌免疫学检测方法
2.6 免疫印迹法（Western blot)
免疫印迹法又称为蛋白质印迹法，是根据抗原抗 体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法。 它综合了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 的高分辨率及ELISA的高敏感性和高特异性，是 一种有效的分析手段，广泛应用于细菌的检测中， 但该方法操作复杂，耗时费力。
2 细菌免疫学检测方法
2.6 免疫印迹法（Western blot)
3 细菌分子生物学检测技术
3.1 核酸探针检测技术 根据完成杂交反应所处介质的不同，分成固相杂
交反应和液相杂交反应。
固相杂交反应是在固相支持物上完成的杂交反应， 如常见的印迹法和菌落杂交法。
液相杂交法指杂交反应在液相中完成，不需固相 支持，优点是杂交速度比固相杂交反应速度快。 缺点是为消除背景干扰必需进行分离以除去加入 反应体系中的干扰剂。
1 细菌传统培养检测方法
1.3 API生化鉴定系统 API（Analytic Products INC）系统用于细菌鉴定的
品种有15种，分别有相应的数据库。数据库由细菌 条目(taxa)组成，每个条目可能因情况的不同代表 细菌种、细菌的生物型、细菌的菌属。
2 细菌免疫学检测方法
2.1 免疫胶体金技术
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体 金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记 技术。
2 细菌免疫学检测方法
2.2 免疫层析技术
免疫层析技术一种将免疫技术和色谱层析技术相 结合的快速免疫分析方法。原理是将特异的抗体 先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的 硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由 于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移 动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即 与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免 疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现 特异性的免疫检测。
2 细菌免疫学检测方法
2.5 乳胶凝集实验（LAT)
LAT是以乳胶颗粒作为载体的一种间接的凝集试 验。利用人工大分子乳胶颗粒抗体，吸附可溶性 抗原于其表面发生肉眼可见的凝集反应，以达到 检测目标细菌的目的。乳胶凝集试验由于具有快 速敏感、简单易行、无需昂贵仪器等优点，已广 泛用于多种病原菌的检测以及流行病学调查中。
CRISPR主要由重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)间隔排列 构成的R-S结构组成，其与CRISPR相关蛋白基因(CRIPSPR
associated，cas)组成CRISPR /cas系统，为原核生物提供对
噬菌体、质粒等外源基因的获得性免疫能力，从而抵抗噬 菌体感染，限制基因的水平转移(HGT)。
与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的 新型培养基。 它是一种新型分离培养基，利用显色培养基进行 微生物的筛选分离，其反应的灵敏度和特异性大 大优于传统培养基。
1 细菌传统培养检测方法
1.2 显色培养基快速检测技术
例：大肠杆菌/大肠菌群显色培养基：用于食品、水、牛 奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测。 大肠杆菌显蓝色至紫色，大肠菌群显红色。
1 细菌传统培养检测方法
1.1 分离培养检测及鉴定方法 食品中病原菌的传统检测方法是将分离培养后的
可疑菌落做涂片染色实验、生化反应实验、溶血 实验、协同溶血实验（CAMP）、动物实验及典型 运动等鉴定等。
1 细菌传统培养检测方法
1.2 显色培养基快速检测技术 显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶
Ct值（Cycle threshold，循环阈值） 的含义为：每个反应管内的荧光信号到 达设定阈值时所经历的循环数
3 细菌分子生物学检测技术
3.3 DNA环介导恒温核酸扩增法
原理：针对靶基因的特定区域设计1种特异的引物， 利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymcrasc) 在65℃左右恒温保存几十分钟，即可完成核酸扩 增反应，且1h内可扩增靶基因至1010倍。反应过程 不会受到反应混合物的影响且受非靶序列DNA分 子的影响较小。同时，在等温条件下扩增，不会 因温度的改变而造成时间损失，并且模板也不需 要进行热变性，从而保证了LAMP扩增的高效特异 性。