第三章 外植体的选择和灭菌

四．外植体大小
目前许多植物的茎尖培养表明，外植体 （茎尖）越小成活率越低。因此除非用 去除病毒，否则不宜将外植体切的太小。 但不是说外植体越大越好，外植体过大， 不易彻底灭菌。
第二节 外植体的灭菌方法
常用灭菌药剂 外植体的灭菌方法
一．常用灭菌药剂及灭菌效果
消毒剂 次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 升汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素 浓度/% 2 9-10 饱和溶液 0.1-1 70-75 10-12 1-2 1 4-50mg/l 清除难易 易 易 易 较难 易 最易 易 较难 中 消毒分钟 5-30 5-30 5-30 2-10 0.2-2 5-15 2-10 5-30 30-60 灭菌效果 很好 很好 很好 最好 好 好 很好 好 较好
2．果实和种子的消毒
视果实和种子的清洁程度，先用自来水 冲洗10-20分钟，甚至更长时间。再用 70%酒精迅速漂洗一次。果实用2%次氯 酸钠溶液浸10分钟，后用无菌水冲洗2-3 次后，就可取出果实内的种子或组织进 行培养。种子则先用10%次氯酸钠溶液 浸泡20-30分钟，对难以消毒的还可用 0.1%升汞或1%-2%溴水消毒5分钟。
1．70%-75%酒精
70%-75%酒精---具有较强的穿透力和杀 菌力，通常外植体浸入15-30秒即可。常 作为表面灭菌的第一步，它具有浸润和 灭菌的双重作用，但不能达到彻底灭菌 的作用，必须结合其它药剂灭菌。有时 为了提高乙醇的杀菌效果，可在乙醇溶 液中加入0.1%的酸或碱，提高乙醇的杀 菌效果。
第三章 外植体的选择和灭菌
第一节 外植体的选择 第二节 外植体的灭菌方法 第三节 污染的原因和预防措施
第一节 外植体的选择
外植体的部位 取材季节 器官的生理状态和发育年龄 外植体大小。
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一．外植体的部位
茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓组织、表皮、 块茎的贮藏薄壁组织、花瓣、根、叶、子叶、 鳞茎、胚珠、花药等 。 不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱 导条件的反应是不一样的 。 还要考虑培养材料的来源是否有保障，是否容 易成苗；同时要考虑该外植体，特别是经过脱 分化的愈伤组织，是否会引起不良变异，丧失 原品种的优良性状。
二．污染的预防措施
培养材料的预处理； 材料内部带菌，可在培养基中加入一定 量的抗生素。
2．升汞（HgCl2）
升汞（HgCl2）是有剧毒的重金属盐杀菌 剂，其杀菌原理是Hg2+可与带负电荷的 蛋白质结合，使菌体蛋白质变性，酶失 活。使用浓度为0.1%-0.2%一般浸泡时 间为6-12分钟。灭菌效果极好，但其清 除较难，通常用无菌水冲洗不得少于5次。
3．次氯酸钠（NaClO）
次氯酸钠（NaClO）---配制1%-10%的次 氯酸钠，灭菌时只需浸泡5-30分钟，再 用无菌水冲洗4-5次即可。易清除，残留 较少，组培中常用。 在用上述几种药剂进行灭菌材料的灭菌 处理时，为了使药剂浸润整个组织，还 需在药液中加入润湿剂。如加数滴0.1% 的吐温80或吐温20。
二．取材季节
不同植物的取材季节要求各有不同。对 大多数植物而言，应在其生长开始的季 节采样 。 在生长末期或已进入休眠期时取样，则 外植体可能对诱导反应迟钝或无反应， 较难成活。 在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活 率高，而且增殖率也大。
三．器官生理状态和发育年龄
外植体的器官，其生理状态和发育年龄 直接影响形态发生。 沿植物的主轴，越向上的部分易形成花 器官 ，植株下部组织产生营养芽的比例 高。 一般情况下，年幼组织比老年组织具有 较高的形态发生能力。
第三节 污染原因和预防措施
培养物污染的原因 污染的预防措施
一．培养物污染的原因
1.培养物污染的原因主要有：外植体带菌；培养 基及器皿灭菌不彻底；操作不规范等。在组织 培养实验中，污染的病原分为细菌及真菌两类。 2. 细菌污染的特点是菌斑呈粘液状物，且在接 种1-2天即可发现，除材料或培养基灭菌不彻 底外，工作人员的不慎也是造成细菌污染的原 因；真菌污染的部分长有不同颜色的霉菌，在 接种3-10天后才能发现，真菌污染的原因多为 周围环境的不清洁，超净台的过滤装置失效， 培养器皿的口径过大等。
3．花药的消毒
用于组织培养的花药，实际上多未成熟 由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护 基本上处于无菌状态，故只需要将整个 花蕾或幼穗消毒即可以了。一般用70% 酒精浸泡数秒，然后用无菌水冲洗2-3次， 再用漂白粉上清液中浸泡10分钟，经无 菌水冲洗2-3次即可接种。 根及地下部器官的消毒与茎叶类似。
二．外植体的灭菌方法
茎尖、茎段及叶片等的消毒 果实和种子的消毒 根及地下部器官的消毒 花药的消毒
1．茎尖、茎段及叶片等的消毒
植物的茎、叶部分多暴露在空气中，易受到泥 土、肥料中的杂菌污染，消毒前需经自来水较 长时间的冲洗，特别是一些多年生的木本植物 材料，冲洗后还要用沾有肥皂粉或洗洁精的软 毛刷进行刷洗。消毒时先用75%酒精浸泡10— 30秒，以无菌水冲洗2-3遍，根据材料的不同， 分别采用1%-10%的次氯酸钠溶液或0.1%的升 汞浸泡8-15分钟。如材料表面有茸毛或凹凸不 平，最好在消毒液中加入几滴吐温。最后在用 无菌水冲洗4-5遍方可接种。