洋葱根尖染色体观察

大蒜根尖多倍体诱导与染色体观察

实验目的：

1、了解利用秋水仙素诱导植物多倍体的方法。

2、掌握大蒜根尖制片的方法。

3、通过对玻片的观察，统计染色体数目。

4、对比不同的大蒜根尖染色体数目，理解二倍体和四倍体的区别。

实验原理：

1.有丝分裂

完整的有丝分裂相包括G1期（合成前期）、S期（合成期）、G2期（合成后期）和M期（分裂期），其中G1期、S期和G2期合称间期，细胞完成DNA的复制以及有丝分裂的准备，而M期又可以分为前期、中期、后期和末期，为了形态观察的方便，本实验采用后一种分法。观察有丝分裂，重点在于观察染色体的形态。在细胞分裂前期，细胞核解体，染色质凝聚显现出染色体的形态；在前中期，染色体散乱地分布于细胞的中部；在中期，纺锤体形成，染色体受到微管的牵引，着丝粒成行排列于赤道板上；在后期，染色体受到动粒微管的牵引，向细胞两级运动；在末期，染色体重新解螺旋，细胞核重新形成。细胞染色体过程示意图见图1.

图1：细胞有丝分裂过程示意图

2.大蒜的根尖

大蒜根尖的整体结构如图2，其中只有分生区的初生分生组织由于细胞始终

处于持久而强烈的有丝分裂之中而作为我们的观察对象，其余部分在制片时都应当尽量剔除来保证观察效果。

图2：大蒜根尖结构示意图

3.多倍体诱导

秋水仙素易溶于冷水、不易溶于热水、有毒、针状结晶或淡黄色粉末，是诱导多倍体的一种常用试剂，其是从百合科植物秋水仙的鳞茎和种子中提取出来的一种生物碱。它的作用机理是与微管蛋白单体结合，抑制微管的形成，进一步抑制纺锤体的形成，使染色单体分离受阻，形成同源多倍体。因此，秋水仙素作用于正在分裂的细胞，如生长点才能产生作用，诱导多倍体的形成。秋水仙素诱导多倍体在蔬菜和观赏植物的应用非常广泛，但是在大蒜方面的报道却很少。

图3：秋水仙素的化学结构式

实验器材：

实验材料：经秋水仙素处理过的大蒜根。（秋水仙素溶液配制取秋水仙素1g（先用少量95%乙醇助溶），溶于250～500ml蒸馏水中，配成浓度为0.2～0.4%的溶液，冰箱中保存。将大蒜架在盛水的烧杯中进行水培。待根尖长到1cm时，将大蒜盛在0.4%秋水仙素溶液的瓶盖或小烧杯上，避光处理24小时，然后再水培24

小时加倍后根尖很肥大。）

实验试剂：1mol/L的HCl溶液，改良苯酚品红溶液。

实验器材：刀片，镊子，双目显微镜，载玻片，盖玻片，烧杯，滤纸。

实验步骤：

1、取材：取大蒜发根至0.5-1cm，然后转入盛有0.15%秋水仙素水溶液

的培养皿中继续培养24小时到30小时，待观察到根部有膨大时取

出固定。（一般植物细胞周期17-18小时）

2、固定：在卡诺固定液中固定24小时，移至70%乙醇中保存或者备用。

3、解离：植物的分生组织需要经过处理以便除去细胞之间的果胶层并

使细胞壁软化，经解离的组织才能使得压片步骤顺利进行。

酸解法：固定的材料用清水洗涤之后，用1M HCL在60摄氏度水浴

中恒温处理5min，在酸解过程中一定要掌握好温度和时间，若解离

不够，则压片不易分散。若解离太过，在下一步处理材料时由于材

料过软而易丢失。

4、水洗：水洗三次，每次一到二分钟。

5、染色：切取根尖分生组织区，用改良苯酚品红染色10-15分钟。

6、压片：将染色后的材料盖上盖玻片，在盖玻片上盖上两层吸水纸，

用一个双面刀片，插到盖片与玻片之间的一角，用左手食指压紧盖

片，防止滑动，用右手持解剖针，用针柄轻敲盖片，使材料均匀分

散开，然后将刀片轻轻撤出，再用针柄重敲盖片，使细胞分散压平。

7、镜检：比较四倍体细胞与二倍体细胞

实验结果：

一、多倍体观察：

细胞内染色体被改良苯酚品红染成紫红色；细胞内染色体数目明显增多，杂乱无章地排列在细胞内部，并未平均移动到细胞两级。

多倍体（1）10*40倍显微镜下观察多倍体（2）10*40倍显微镜下观察

2.染色体计数

实际值实际计数值相对偏差二倍体16 -- 0

多倍体（1）32 29 9.37%

多倍体（2）32 30 6.25%

结论：实际计数值与实际值存在偏差，一方面由于压片不充分，另一方面立体细胞使得染色体容易出现重叠现象。通过观察，细胞大致分散开，没有出现堆叠情况，判断解离效果良好。

六、注意事项

1、解离的时间要适当，大约5min，因为解离时间的长短与实验结果的好坏有非常直接的影响，时间过长，则不仅破坏分生组织之间的果胶与纤维素等物质，也使分生组织与伸长区脱离，染色效果将会降低，而过短，则又达不到分离细胞的结果。

2、在切取根尖时大约切从根尖开始算往上1.5mm左右，若切得太短，则只会看到成熟的根冠细胞，在视野中看不到分裂期细胞；若切得太长，则会看到有很多伸长区的成熟细胞，从而影响实验结果。

3、染色时间不宜过长或过短，染色过深或过浅都会影响最终的实验结果。

4、压片时用拇指从上往下垂直用力且要避免载玻片与盖玻片之间的滑动，否则会使细胞之间重叠，影响观察。

5、观察时先用低倍镜找到分裂相的位置，再换高倍镜观察。

七、实验拓展

秋水仙素应用价值：

自1937年布莱克斯和埃佛里采用曼陀罗等植物发现用秋水仙素诱导多倍体的方法后, 广大育种工作者开始探索多倍性育种技术手段,多倍体植株叶片大而厚, 颜色深邃,花朵大而质地加重, 花期延长等外观特征符合现代育种目标,增加了花卉的观赏价值和商品价值, 带动了花卉产业的迅速崛起。现有的技术手段中,通过秋水仙素人工化学诱变的方式仍然被认为是最有效、成绩为显著的一条途径, 其具有经济方便、诱变作用专一和诱变突变广泛等特点, 一直沿用至今。如在金丝杜鹃、大波斯菊、草夹竹桃、矮牵牛、毛地黄、紫茉莉、金莲花、金鱼草、鸡冠花、挂竹香等植物中都通过秋水仙素诱导成功, 已获得了同源四倍体植株。在提高观赏价值的同时也获得了巨大的利益。

应用前景：

随着研究的进一步深入, 用秋水仙素加倍还存在着一些亟待解决的问题: 1、缺陷问题。秋水仙素诱变产生的第一代多倍体, 基因平衡遭到破坏, 存在一

些缺陷, 如孕性低、种子不饱满、生长期较长、开花较晚等。因此不能直接用于生产, 只能在进一步加以改善, 克服缺陷后才能在生产上发挥优势。2、嵌合体问题。由于分生组织细胞分裂的不同步性, 用秋水仙素处理时并不是

所有细胞都加倍为多倍体, 也可能有一部分细胞染色体未加倍, 染色体未