流式细胞术原理及应用 ppt课件
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• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
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常用荧光素
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常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
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10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
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粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
实验步骤：
•细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
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• FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
5%
32%
默认阈值
升高阈值后
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荧光信号
•细胞自发荧光 •特异荧光素标记激发的荧光信号 •荧光信号的线性测量和对数测量---光电倍增管
1）检测光子，转换成电信号 2）将电信号等比例的放大 •荧光信号的面积、宽度和高度
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二、荧光素
•荧光的概念：
激发波长 Excitation wavelength
＜
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
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•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
• 荧光素（FITC/PE/PerCP/APC等) 抗体偶联荧光素； 分子探针结合荧光素Annexin V-FITC；
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• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信 号的放大可以使用线性或对数两种方式。
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大 ，多使用对数放大。
•线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白
含量
•对数测量：细胞膜表面抗原检测
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直方图（Distribution Histogram） 散点图（Dot Plot）
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1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
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B、根据抗原表达强弱合理分配荧光素
• 荧光素的强度： 染色指数 Stain Index
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。 • AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，
• 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的 A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定 量染料。
流式细胞术原理及应用
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1
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
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2
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直线 流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量分 析和分选技术.
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8
光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
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信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
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6
流动室与液流驱动系统
1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样
流动室，430×180um,鞘液
Injector Tip Sheath
fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
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7
激光光源与光束成形系统
1.氩离子气体激光器，22×66um 2.固体激光器 405nm, 488nm,561nm,635nm
• 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合 成微球等。
• 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量 分析。
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3
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4
流式细胞仪构造图
Hale Waihona Puke ppt课件5流式细胞仪五大系统
• 流动室与液流驱动系统 • 激光光源及光束成形系统 • 光学系统 • 信号检测与分析系统 • 细胞分选系统
Stain Index = D/W
CD4
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• 高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表 达低的抗原：
CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
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常用荧光素
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常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
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• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
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粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
实验步骤：
•细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
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• FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。
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32%
默认阈值
升高阈值后
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荧光信号
•细胞自发荧光 •特异荧光素标记激发的荧光信号 •荧光信号的线性测量和对数测量---光电倍增管
1）检测光子，转换成电信号 2）将电信号等比例的放大 •荧光信号的面积、宽度和高度
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二、荧光素
•荧光的概念：
激发波长 Excitation wavelength
＜
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
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•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
• 荧光素（FITC/PE/PerCP/APC等) 抗体偶联荧光素； 分子探针结合荧光素Annexin V-FITC；
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• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信 号的放大可以使用线性或对数两种方式。
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大 ，多使用对数放大。
•线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白
含量
•对数测量：细胞膜表面抗原检测
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直方图（Distribution Histogram） 散点图（Dot Plot）
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1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
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B、根据抗原表达强弱合理分配荧光素
• 荧光素的强度： 染色指数 Stain Index
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。 • AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，
• 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的 A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定 量染料。
流式细胞术原理及应用
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一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
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一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直线 流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量分 析和分选技术.
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光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
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信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
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流动室与液流驱动系统
1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样
流动室，430×180um,鞘液
Injector Tip Sheath
fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
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激光光源与光束成形系统
1.氩离子气体激光器，22×66um 2.固体激光器 405nm, 488nm,561nm,635nm
• 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合 成微球等。
• 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量 分析。
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流式细胞仪构造图
Hale Waihona Puke ppt课件5流式细胞仪五大系统
• 流动室与液流驱动系统 • 激光光源及光束成形系统 • 光学系统 • 信号检测与分析系统 • 细胞分选系统
Stain Index = D/W
CD4
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• 高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表 达低的抗原：
CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE