体外分析技术 讲义- 中国医科大学
(核医学课件)02.RIA体外分析技术
反应到达平衡快
非特异结合主要影响高剂量区 非特异结合主要影响低剂量区
低剂量区有不确定因素
低剂量区无不确定因素
B% B%
拟合的标准曲线
拟合的NSB
RIA的标准曲线及 非特异结合曲线
IRMA的标准曲线及 非特异结合曲线
拟合的标准曲线
拟合的NSB
IRMA与RIA工作原理的主要区别
RIA
IRMA
竞争性抗原抗体结合反应 非竞争性抗原抗体结合反应
2）半衰期足够长 3）保持原有抗原的特性
125I—大分子、3H or 125I—小分子
二、基本方法
（一）基本试剂
1、抗体 2、标记抗原
3、非标记抗原 （标准品）
高纯度 化学结构、免疫活性 与被测抗原相同
二、基本方法
（二） B和F的分离
1、第一类 双抗体沉淀法
PEG沉淀法
Ag
+
Ab(1)
可溶性复合物
5、健全Hale Waihona Puke （perfectly） 平行性试验
C
3、灵敏度 （sensitivity） 方法的最小可测量
6、稳定性（stability） B0%，NSB，ED25，ED50，ED75
RIA 小 结
• 灵敏度高 • 特异性好 • 精确的定量 • 方法操作简便
B%
第二节 免疫放射分析法
（immunoradiometric assay,IRMA） Ag + *Ab
B1% B2% B3% B4% B5% B6% B%
Ab
分离B、F
*Ag
Ag 1 2 3 4 5 6 ？
25 50 100 200 400 800
B% F% B/F
体外分析技术PPT
缺点
至少两株抗体：主要限于肽类和蛋白质，很多 小分子半抗原不能应用。
缓冲液PH及离子强度要求严格。
应用
CEA、AFP、铁蛋白、HbsAg、ACTH、PHA、 胰岛素、FSH，TSH、降钙素、血管紧张素I& II 、抗血友病因子、凝血VIII因子等 。
IRA与IRMA的区别
反应类型 结合类型 标记物 待测物 RIA 免疫反应 竞争结合 抗原 抗原 IRMA 免疫反应 非竞争 抗体 抗原
结合与游离部分的分离
快速而完全分离。 操作简便，来源容易，价格便宜。 不受血清、外界条件及其它试剂的干扰。 适用于任何容积的反应液。 非特异结合率小。
常用液相分离技术: 收集抗原抗体复合物（B）
双抗体沉淀法:
分离完全，非特异结合小，环境影响小，效 价高，但 成本高.
聚乙二醇(PEG)沉淀法:
标记物 抗原 抗体
待测物 抗原 抗原
RBA 受体配体
非竞争
配基 受体 数量和性质
非放射性标记免疫分析
提高灵敏度 减少放射性废物 原理相同 探测信号不同 探测仪器不同
一、酶标记免疫分析
(enzyme immunoassay, EIA)
EIA和 IEMA（酶免疫分析法）的测定原理与 RIA和IRMA相同，竞争结合和非竞争结合。 IEMA应用最多-酶联免疫吸附分析(ELISA)。
只是用酶替代标记抗原或抗体的放射性核素 常用的酶辣根过氧化酶(HRP),底物四甲基联苯
胺(TMB) 分光光度计检测
二、化学发光免疫分析
化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay CLIA） 标记物为能产生化学发光的化合物，如异鲁米娜、甲基 氮蒽。碱性条件下遇过氧化物有单光子发射。缺点:发 光时间短。
核医学课件：体外分析技术
标准曲线
目前已普遍采用计算机进行数据处 理，自动绘制标准曲线，自动换算 样品中被测物质的浓度
实验操作基本步骤
1.加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境 也要一致。
2.孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间 不同，一般是37℃。
3.分离：选择好的分离方法分离游离抗原和 抗原－抗体复合物。 4.测量：测量游离或结合物部分的放射性。 5.数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算
* Ag
基本反应式
Ag-Ab
*Ag:标记抗原，Ag 非标记抗原 Ab：抗体 *Ag- Ab 标记抗原抗体复合物 Ag- Ab 非标记抗原抗体复合物
Ag-Ab+Ag
条件：1.*Ag与Ag 免疫活性相同
2. *Ag与Ab 恒量
*Ag-Ab+*Ag
理
*Ag与Ag由于免疫化学性质一致，共同竞争 性与Ab结合，当*Ag和Ab的量保持恒定， *Ag与Ag之和大于Ab时，则*Ag-Ab复合物的 形成受Ag含量的制约，二者之间存在函数关 系 ， 即 Ag 量 越 大 ， *Ag-Ab 量 越 小 ； Ag 量 越 小，*Ag-Ab量越大；测定*Ag-Ab或*Ag量即 可推算出被测Ag量
量B、F的cpm
*Ag
B%=B/(B+F)
Ag 1
2
3
4
5 6？
25 50 100 200 400 800
B%
B% 标准曲线
常 用 的 反 应 参 数 有 B%，B/F，F/B、 F%等这些反应变量都可以用作纵坐标来对 应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应 变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这 些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗 原浓度变化而变化的函数关系。
《体外分析技术》
第四节 体外分析技术临床应用
垂体及生殖激素
项目 英文缩写 (HCG) (GH) (PROG) (PRL) (FSH) (LH)
人绒毛膜促性腺 激素（血、尿）
生长激素 孕酮 泌乳素 促卵泡生成素 促黄体生成素
临床意义 妊娠↑，孕期9-12周血浓度达最高峰，也用于绒毛 膜癌、恶性葡萄胎诊断及术后评估 分泌不足会导致身材矮小、缺乏生长潜能，分泌过 多引起巨人症和肢端肥大症 用于排卵期、早孕状态和黄体期生育力评估 用于诊断高泌乳素血症性闭经、溢乳、男子女性型 乳房、垂体增生、垂体肿瘤、泌乳素瘤、原发不孕、 子宫功能性出血、垂体前叶功能减退等 常用于诊断染色体异常的先天性疾病、闭经、多囊 卵巢综合征、更年期综合征
体 外 分 பைடு நூலகம் 技 术
体外分析技术
In vitro analysis techniques：是指离体的组织、
血液或体液等作为生物样本，在人体外进行的、分 析样本成分或其含量的检测技术。
特点：超微量分析的灵 敏度，高强度的特异性 以及简便快速的方法领 先于其他定量分析技术。
重点讲述
1
2 3
放射免疫分析
第一节 放射免疫分析
基本原理
以Ag*Ab复合物为B， 未结合的 Ag* 为 F ，则 B/F或B/(B＋F)与Ag的 由此可的制作该反应 的标准曲线 。
量变存在着函数关系，
第一节 放射免疫分析
基本试剂
抗 体
｛
标 准 品
亲和力 特异性 滴度
比活度 放射性化学纯度 免疫活性
抗原抗体复合物
分离 方法
标记 抗原
免疫放射分析 非放射免疫分析
4 体外分析技术临床应用
第一节 放射免疫分析
体外分析技术培训课件
3. RIA标准曲线制作
γ-计数仪：实际测量的放射性信号 是仪器输出的电脉冲数，单位为： cpm（counts perminute）或者 cps（counts persecond）。
γ-免疫计数仪
标记物与被测物之间的函数关系可以用标准竞争抑 制曲线（标准曲线）来表示。 制作方法：
将药盒中一系列已知浓度（递增）的标准品抗 原（标准品），分别加入相应的试管； 加入固定量的*Ag和Ab； 待竞争结合反应达到平衡后，分离抗原的结合 部分和游离部分； 用放射性测量仪（γ-计数仪）测定*Ag-Ab。 （B）或游离*Ag（F）的放射性，在坐标纸或计 算机拟合曲线。
核医学体外分析是对取自人体的生物样本进行微生物学、免疫、化学、 血液学、生物物理、细胞学、病理学或其他检测，为人类疾病早期诊断、预 防、治疗或健康评价提供信息的学科。体外分析技术分为放射分析和非放射 性分析技术。
本文• 档核所医提学供（的第信息9版仅）供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
改变标记物
与基础多个学科；
荧光：FIA（RMA）； 化学发光：CLA；
➢ RIA显像； ➢ RIA治疗。
酶：EIA。
放射免疫分析法原理与体外分析技术发展示意图
RIA是所有标记免疫分析的基础，超微量分析的检测源于RIA，RIA及在
此基
础上发展起来的检测方法，是临床医疗不可缺的诊断、治疗疗效评价的
手段
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常用的计算方式有B、B/B0%等。 B或B/B0%作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标准曲线
五、 体外分析技术
第五章体外分析技术第一节放射免疫分析的基本原理放射免疫分析的基础是抗原和相应的抗体能进行特异性结合。
放免分析体系中有两种抗原，即未标记抗原（Ag)和标记抗原（*Ag),两者都与抗体（Ab）有相同的结合能力，且两者的总和大于抗体的量，两种抗原与抗体的结合将彼此竞争，互相抑制。
反应体系中每管所加*Ag和Ab量相同，而Ag量不同，随着Ag量的增加，*Ag与Ab的结合（B）将减少，经实验和理论证明，B与Ag量成函数关系。
在实际的反应体系中有两种Ag，即已知成梯度浓度的一系列标准品和未知浓度的待测样品，两者在严格相同的条件下与*Ag及Ab反应，反应结束后，以标准品的浓度为横坐标，结合率为纵坐标，绘制出标准曲线。
再以待测样品的结合率从标准曲线上查出其含量来。
第二节放射免疫分析法的建立和基本试剂（一）抗体衡量抗体的指标有（1）抗体的亲和力，（2）抗体的特异性，（3）抗体的滴度。
（二）标记抗原对标记抗原的要求是（1）标记后保持抗原的生物特性；（2）有效期较长；（3）比活度和放化纯度要高。
（三）标准品对标准品的要求是（1）含量要准确，（2）与待测样品的抗原特性相同,(3)不含干扰反应的物质。
（四）基本操作过程1.在试管内加入Ag（包括标准品和待测样品）*Ag和Ab。
2.温育。
3.分离游离抗原和抗原抗体复合物。
4.测抗原抗体复合物的放射性。
5.数据处理。
第三节分离方法和数据处理一、分离方法1.中止反应后收集抗原抗体复合物测放射性(B) 常用方法有以下几种:(1)聚乙二醇(PEG)沉淀法。
（2）双抗体沉淀法。
（3）葡萄球菌A蛋白沉淀法。
（4）其它。
2.收集游离抗原测放射性(F) 常用活性炭吸附法.3.固相法将抗体吸附于固相支持物上,当反应达到平衡后,抗原抗体复合物就留在支持物上,倒去上清液,再洗涤数次,测定固体支持物上的放射性B。
（二）数据处理1.手工作图法根据标准管测得的数据算出结合率，以标准品浓度为横坐标，结合率为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。
(核医学课件)02.RIA体外分析技术
RIA体外分析技术的优势与局限
1 优势
高灵敏度：能够检测极低浓度的物质
2
高特异性：能够准确区分类似结构的分 子
3
4 局限
广泛应用：适用于多种生物样品和分析 物质
放射性污染风险，需要严格的实验室操 作控制
常见的RIA体外分析技术方法
RIA技术在医学诊断和研究中有多种变种：
• 双抗体RIA • 竞争性RIA • 免疫放射分析（IRMA） • 固相RIA • 辐射免疫沉淀法（RIP）
放射性示踪技术
免疫学
RIA利用放射性示踪技术标记 分析物质，使其具备辨识性， 进而实现可靠的浓度测定。
RIA基于抗原抗体反应原理， 利用特异性抗体对待测物质 进行检测，确保高特异性和 高敏感性。
实验室应用
RIA广泛应用于医学诊断、生 物医学研究和临床实验，可 检测和分析激素、肿瘤标志 物、免疫功能指标等生物分 子的含量。
激素诊断
RIA可用于测定病。
肿瘤标志物检测
RIA可以精确测定血液或组织中的肿瘤标 志物，用于早期诊断、治疗监测和预后评 估。
免疫功能检测
RIA在评估免疫功能指标，如免疫球蛋白、 细胞因子等方面发挥重要作用。
药物浓度测定
RIA可测定药物在体内的浓度，用于调整 和监测药物治疗的效果。
(核医学课件)02.RIA体外 分析技术
为了有效地进行医学诊断，了解RIA体外分析技术的原理和应用至关重要。本 节将介绍RIA体外分析技术的基本知识和发展前景。
RIA体外分析技术的概述
RIA体外分析技术是一种高灵敏度、高特异性的实验室分析方法，用于测量微量物质在体内或体外 的浓度。通过结合放射性示踪技术和免疫学，RIA可以检测和定量分析各种生物分子。
体外分析技术PPT课件
坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同
浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是
剂量反应曲线。
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B1% B2% B3% B4% B5% B6%
Ab
分离B、F
*Ag
B%=B/(B+F)
F%=F/(B+F)
R=B/F
Ag 1 2 3 4 5 6
浓度 25 50 100 200 400 精选ppt课件最新 800
Ag < *Ag , *AgAb (B) *Ag (F)
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Ag + *Ag + Ab ++
+
+
++
*AgAb + AgAb + *Ag +Ag
+
+
+
+
+
+
++
+
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+
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（二）剂量反应曲线：标准曲线
标记物与被测物之间的函数关系可以用剂量
反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列 标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准 曲线。
临床化学分析
10-3
10-0
mg/mL
g/L
免疫分析
Therapeutic Drugs
Thyroid Hormone
Fertility Hormone
Allergy Cancer Markers Infectious Disease Vitamins Serum Proteins
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体外分析技术 PPT课件
基本原理
用过量的标记抗体与非标记抗原形 成复合物，用免疫吸附剂除去多余的游 离抗体，复合物的放射性与非标记抗原 的量成正比。
IRMA的主要特点
• 属于非竞争性抗原抗体结合反应 • 抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原的量呈 正相关 • 在低剂量下不会有不确定因素 • IRMA的非特异性结合对低剂量区影响大，对 分离条件的要求严格。对于RIA来讲，低剂量 区放射性高，非特异结合主要影响高剂量区。
体外分析技术
体外分析技术分类
• 放射免疫分析法 • 免疫放射分析法 • 非放射性标记免unoassay， RIA
• 基本原理 • 基本方法 • 质量控制
基本原理
利用特异抗体与标记抗原和非标记 抗原的竞争结合反应，通过测定放射性 复合物量来计算出非标记抗原量的一种 超微量分析技术。
三种标准曲线 F=游离*Ag, B=*AgAb, F+B=总*Ag
B/(B+F)
F/ (B+F)
B/F
基本试剂
• 抗体：高亲和力、高特异性、高滴度 • 标记抗原 （1）比活度和放化纯度必须足够高，以保证 分析的灵敏度 （2）半衰期不能太短，使之有足够长的寿命 以完成整个分析过程 （3）不改变原有抗原的特性（特异性、亲和 力、免疫活性等） • 标准品
RIA操作的基本步骤
• • • • • • 加样 孵育 分离结合与游离部分 测定放射性 数据处理，打印报告 废物处理
复合物和游离抗原的分离
• 抗原抗体在液相环境中起反应，终止反应时用 一定方法收集复合物测量放射性 ：双抗体沉淀 法，聚乙二醇沉淀法、葡萄球菌A蛋白沉淀法、 活性炭吸附法、微孔滤膜过滤法等。 • 预先将抗体吸附在某种固体支持物上，抗原抗 体反应就在支持物上进行，反应结束后只需将 周围未结合的游离抗原洗去，测定固体支持物 上的放射性。
体外分析技术
体外分析技术体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。
该类技术的特点是高灵敏度和高特异性，广泛用于临床和科学研究的很多领域。
应用最多的是：放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。
第一节放射免疫分析一、原理放射免疫分析法 (radioimmunoassay,RIA) 的基本原理是，限量标记抗原[*Ag]和可变量的非标记待测抗原[Ag]与定量的特异抗体[Ab]发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。
这一过程可用下式表示：*Ag + Ag + Ab [AgAb]* + [AgAb]上述式中，Ab的分子数少于*Ag，因此即使系统中没有Ag，仅有*Ag，当反应达到平衡时，绝大部分 (因为是可逆反应，不会是100%) Ab将形成*AgAb复合物。
如果系统中加入Ag，则Ag与*Ag竞争结合Ab，形成AgAb，*AgAb将减少。
Ag越多则*AgAb越少。
实践和理论推导都证明，*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系，如以Ag为横坐标，*AgAb (B)或*AgAb 占加入总*Ag的% (B%)为纵坐标，是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。
如以游离的*Ag (F)或游离*Ag占加入总*Ag的% (F%)为纵坐标，则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
也可以*AgAb/*Ag的比值 (R)为纵坐标，也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
分析中，首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线 (也称标准曲线)，然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。
二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供，提供RIA的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。
使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当修改，但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。
《体外分析技术》课件
行业意义与价值
体外分析技术的发展不仅提 高了医疗诊断和药物研发的 效率，还对人类健康和食品 安全产生了积极的影响。
六、参考文献
• 文献1 • 文献2 • 文献3
《体外分析技术》PPT课 件
欢迎来到《体外分析技术》PPT课件！在本课程中，我们将介绍体外分析技术 的概念、应用和优缺点，以及其在医学、生物学和食品安全监测等领域的重 要性。
一、介绍体外分析技术
什么是体外分析技术
体外分析技术是指在体外环境下进行的生化分析方法和ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ验技术。
体外分析技术的主要用途
体外分析技术被广泛应用于医学诊断、药物筛选、生物学研究和食品安全监测等领域。
免疫荧光染色 法 （Immunofluo rescence staining）
利用荧光标记的抗体 在细胞或组织中检测 目标分子的方法。
质谱分析法 （Mass spectrometry）
一种用于分析样品中 化合物结构和组成的 分析技术。
三、体外分析技术的应用
1 医学诊断
体外分析技术在临床医学中被广泛应用于疾 病诊断、治疗监测和病原体检测等方面。
缺点
假阳性率高，可能会导致误诊和误判；限制性较大， 一些分析方法只适用于特定的样品类型；操作技术 要求高，需要专业人员进行分析和解读。
五、结论
体外分析技术的应用前 景
随着科技的进步和人们对健 康的关注，体外分析技术在 医学和生命科学领域的应用 前景非常广阔。
体外分析技术的发展方 向
未来的发展方向包括提高分 析方法的灵敏度和准确性， 开发更多适用于复杂样本的 分析技术。
体外分析技术的发展历程
体外分析技术经历了从传统的化学分析到现代的基于生物分子相互作用的分析方法的发展。