免疫血清制备

IgG类抗体的纯化 IgG类抗体的纯化
1．盐析法粗提γ球蛋白 盐析法粗提γ 2．离子交换层析提取IgG ：DEAE 离子交换层析提取IgG 3．亲和层析法
抗血清的保存
①4℃保存：抗血清在鉴定纯化前可保存在4℃冰箱内， 保存：抗血清在鉴定纯化前可保存在4 冰箱内， 为防止细菌污染可将血清过滤除菌或加入防腐剂。 为防止细菌污染可将血清过滤除菌或加入防腐剂 。 4℃保存的期限为三个月或半年。 保存的期限为三个月或半年。 ②冷冻保存：是常用的抗血清保存方法，将抗血清分 冷冻保存：是常用的抗血清保存方法， 为小包装保存于–20～ 70℃ 可保存2 为小包装保存于–20～–70℃，可保存2～3年抗体效 价无明显下降，但要避免反复冻融。 价无明显下降，但要避免反复冻融。 ③真空干燥保存：抗血清分装后，用真空干燥机进行 真空干燥保存：抗血清分装后， 干燥， 制成干粉 （ 水分 ≤ 干燥 ， 制成干粉（ 水分≤ 0.2% ） ， 密封后在普通冰 箱内可保存4 箱内可保存4～5年抗体效价无明显变化。 年抗体效价无明显变化。
抗原的两种特性： 抗原的两种特性：免疫原性与抗原性 免疫原性的本质——异物性 异物性 免疫原性的本质 与机体亲缘关系越远， 与机体亲缘关系越远，组织结构的差异 越大，异物性越强。 越大，异物性越强。
影响抗原免疫应答的因素
理化特性 化学性质 分子量大小 结构的复杂性 分 子构象 物理状态 遗传、年龄、性别与健康状态 免疫方法 剂量、途径、次数以及免疫佐剂 的选择
（二）目的蛋白质的提纯
1．超速离心 2．选择性沉淀法 3. 凝胶层析法 4．离子交换层析 5．亲和层析
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免疫佐剂
佐剂（ adjuvant） 佐剂 （ adjuvant ） 与抗原一起或预先注 入机体时可有效增强免疫应答的强度或改 变免疫应答的类型的非特异性免疫增强剂 佐剂本身可以有免疫原性， 佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免 疫原性。 疫原性。
（二）细菌免疫原的制备
选用经鉴定合格的标准菌株， 选用经鉴定合格的标准菌株 ， 接种于固体 或液体培养基， 置温箱37℃ 培养24h 或液体培养基 ， 置温箱 37℃ 培养 24h 增菌 后 处 理 。 菌 体 抗 原 需 要 100℃ 水 浴 2 ～ 100℃ 2.5h杀菌并破坏鞭毛抗原后应用；而鞭毛 抗原要用有动力的菌株， 菌液用 0 抗原要用有动力的菌株 ， 菌液用0.3 ％ ～ 0.5％甲醛处理；细菌毒素抗原则应在杀菌 后再加入0 后再加入 0.5％～1％氯化钙溶液方可使用。 氯化钙溶液方可使用。 有些寄生虫卵也可制成抗原悬液供免疫用。 有些寄生虫卵也可制成抗原悬液供免疫用 。
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二、可溶性抗原的制备和纯化
（一）组织和细胞抗原的粗提 （二）目的蛋白质的提纯 （二）目的蛋白质的提纯 （三）抗原与佐剂的乳化
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（一）组织和细胞抗原的粗提
（1）组织匀浆的制备 （2）细胞的破碎 — 反复冻融法 — 冷热交替法 — 超声破碎法 — 自溶法 — 溶菌酶处理法 — 表面活性剂处理法
免疫血清的纯化
由抗原免疫动物制备的免疫血清是成分复 杂的混合物，除了含有特异性抗体外， 杂的混合物，除了含有特异性抗体外，还 存在非特异性抗体和其他的血清成分。 存在非特异性抗体和其他的血清成分。因 此，在应用抗血清前必须先行纯化，以去 在应用抗血清前必须先行纯化， 除杂抗体防止血清中的其他成分干扰试验 结果。 结果。
实验设计
免疫原制备 颗粒性抗原 可溶性抗原 半抗原 动物的选择 佐剂 免疫方案
免疫原的制备
一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、人工抗原的制备
一、颗粒性免疫原的制备
天然的颗粒性免疫原主要是指人、动物或 寄生虫的细胞以及细菌抗原等，制备方法 相对较简单。 绵羊红细胞的制备 细菌免疫原的制备
佐剂的作用机理
① 改变抗原的物理性状 ， 增加抗原在体内的 改变抗原的物理性状， 潴留时间 ②通过刺激单核-巨噬细胞，增加对抗原的处 通过刺激单核-巨噬细胞， 理和提呈能力 ③ 刺激淋巴细胞的增殖分化 ， 从而增强和扩 刺激淋巴细胞的增殖分化， 大免疫应答的能力
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实验方案（鼠抗BSA血清制备） 实验方案（鼠抗BSA血清制备） 动物选择：雌性昆明鼠，约20g／只。 动物选择：雌性昆明鼠，约20g／只。 免疫剂量、途径： 免疫剂量、途径：50ug /只，双足垫及皮 /只，双足垫及皮 内注射，再次免疫剂量减半。 佐剂：弗氏佐剂，初次免疫使用完全弗氏 佐剂：弗氏佐剂，初次免疫使用完全弗氏 佐剂，再次免疫使用不完全弗氏佐剂
W1 W2 W3
初次免疫
再次免疫
未免疫血清采集
初次免疫血清采集
再次免疫血清采集
分离血清
尾巴或眼眶取血，静置（或 37℃30min，4 37℃30min， ℃ 1h）待血液凝固血块收缩析出血清， 1h）待血液凝固血块收缩析出血清， 3000rpm离心15min，取上清，置冰箱保 3000rpm离心15min，取上清，置冰箱保 存备用
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佐剂的种类
目前应用最多的是福氏佐剂(Freund adjuvant) 。 目前应用最多的是福氏佐剂 (Freund adjuvant)。 它是由液体石蜡、 羊毛脂和卡介苗混合而成 。 它是由液体石蜡 、 羊毛脂和卡介苗混合而成。 福 氏佐剂又可分为两种： ①不完全福氏佐剂:是由液体石蜡与羊毛脂按1～5： 不完全福氏佐剂:是由液体石蜡与羊毛脂按1 1比例混合而成； ② 福氏完全佐剂 : 在不完全佐剂中加卡介苗 ( 终浓 福氏完全佐剂: 在不完全佐剂中加卡介苗( 度为2 20mg/ml)，即成为完全福氏佐剂。 度为2～20mg/ml)，即成为完全福氏佐剂。在免 疫动物时，应先将福氏佐剂与抗原按1 疫动物时，应先将福氏佐剂与抗原按1:1体积比混 匀，制成 “油包水”乳化液。 油包水”乳化液。
抗体效价的测定
根据抗原性质不同，可采取不同抗体效价 测定方法。 颗粒性抗原可采用凝集试验。 可溶性抗原常用免疫双扩散法、间接 ELISA。 ELISA。
ELISA法检测血清抗体效价 ELISA法检测血清抗体效价
1:100
1:200
1:400
1:800
1:1600
1:3200
1:6400
1:12800
免疫血清制备
抗体制备技术发展的 三个阶段
用纯化抗原免疫动物获得的血清多克隆抗 体为第一代抗体。 用B细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体为 第二代抗体。 第三代为基因工程抗体。上述抗体的制备 方法与特点各不相同。
实验原理
将已知一定浓度的抗原注射免疫健康动物, 将已知一定浓度的抗原注射免疫健康动物, 经一定时间后, 经一定时间后,动物血清中可产生大量特异 性抗体，这种含有特异性抗体的血清称免 性抗体，这种含有特异性抗体的血清称免 疫血清。 疫血清。 多克隆抗体， 多克隆抗体，回忆应答 抗体的产生通常与抗原的质和量 抗原的质和量、 抗体的产生通常与抗原的质和量、动物种 以及接种途径有密切关系。 接种途径有密切关系 类以及接种途径有密切关系。
1:25600
1:51200 1:102400 1: 204800
结果判定：白色背景上肉眼观察，颜色越深，阳性程度越 强，阴性反应为无色或极浅，依据颜色深浅，以“ 强，阴性反应为无色或极浅，依据颜色深浅，以“+” “-” 表示，稀释倍数最大的“ 表示，稀释倍数最大的“+”为抗体效价。 酶标仪450nm检测吸光度，>阴性对照OD值 2.1为阳性， 酶标仪450nm检测吸光度，>阴性对照OD值*2.1为阳性， 稀释倍数最大的阳性孔其稀释倍数为该血清抗体效价。
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（一）绵羊红细胞的制备
绵羊红细胞是制备溶血素的免疫原， 绵羊红细胞是制备溶血素的免疫原 ， 制备 方法是采集健康绵羊的静脉血， 方法是采集健康绵羊的静脉血 ， 立即注入 无菌带有玻璃珠的三角烧瓶内， 无菌带有玻璃珠的三角烧瓶内 ， 充分摇动 15～20min，以除去纤维蛋白，即得抗凝 15～20min，以除去纤维蛋白， 绵羊全血。 免疫动物前， 绵羊全血 。 免疫动物前 ， 取适量抗凝血于 离心管中， 以无菌生理盐水洗涤细胞 3 离心管中 ， 以无菌生理盐水洗涤细胞3 次 （ 每次2000 rpm离心 10min ） ， 然后取 每次 2000 rpm 离心10min） 压积红细胞，稀释成10 /ml浓度的细胞悬 压积红细胞，稀释成106/ml浓度的细胞悬 液，即可应用。 即可应用。
抗原制备
1.5mlBSA
1.5ml完全 福氏佐剂 搅拌10-15min
完全乳化
滴于水中经久不散
成 “油包水”乳化液 油包水”
电动免疫佐剂搅拌器
实验方案（鼠抗BSA血清制备） 实验方案（鼠抗BSA血清制备） 免疫佐剂制备及动物初次免疫（1d） 免疫佐剂制备及动物初次免疫（1d） 再次免疫及血清采集（7 10d） 再次免疫及血清采集（7-10d） 血清采集及抗体检测（7 10d）（如效价 血清采集及抗体检测（7-10d）（如效价 <10-5,可进行第三次加强免疫）