第13章生物技术应用在园艺植物育种中应用

• 2）未授粉子房培养
• （1）材料的选择
• 接种时胚囊所处的发育阶段对子房培养的 成败起着关键性作用。有的可根据开花前 的天数、未开放花蕾长度来选择子房进行 培养，但更多的是根据胚囊发育时期的相 关性来选择较准确的培养时期，接近成熟 的胚囊较容易诱导成功。
• （2）培养基及培养条件
• 常用的基本培养基有MS、N6和BN等，蔗糖 质量浓度多为3%～10%之间，激素种类及配
第13章 生物技术在园艺植物育种中的应用
13.1 细胞工程与育种
• 植物细胞工程是指以植物细胞全能性为理论基础，以植物组织 及细胞培养为技术支持，在细胞水平上对植物进行遗传操作， 实现植物改良和利用，或获得植物来源的生物产品的生物技术。 植物细胞工程主要包括植物组织与器官培养技术、花药及花粉 培养技术、胚胎培养技术、离体受精技术、体细胞突变体筛选 技术、原生质体培养与细胞融合技术等。近年来，随着这些技 术的发展与完善，及其与常规育种技术的有效集成，在快速繁 殖、种质保存、品种选育和遗传改良等许多领域得到广泛运用， 显示出了巨大的潜力。
形态特征来切取合适发育期的胚囊。此外，在接种前经低温预 处理或预培养后也可得到较好的效果，如向日葵将其花序在 10℃预处理一周，可提高诱导率。 • （2）培养基及培养条件 • 应用较多的基本培养基有White、Nitsch、MS和N6等。一般情况 下，培养基中蔗糖质量浓度为3～12%，多数为5%。大多数植物 胚珠培养温度要求在25℃左右，但不同植物之间也有所差异。
• （3）培养方法
• 常用悬滴培养和液体浅层培养。悬滴培养 时，每滴可接种50～80粒花粉；液体浅层 培养用直径5cm的培养皿，加2.5mL花粉悬 浮液，花粉密度为每毫升104～105个。
13.1.2 未受粉胚珠和子房培养
• 1）未授粉胚珠培养 • （1）材料的选择 • 胚囊发育时期是未授粉胚珠培养成败的关键。可根据花的外部
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13.1.3 离体受精
• 所谓离体受精也称离体授粉，就是把未授粉的胚珠或子房从母体上切离下来，进 行无菌培养，并以一定的方式授以无菌的花粉，使之在试管内实现受精。应用这 项技术，可使花粉不经柱头和花柱组织而直接进入子房中的胚珠，有可能克服孢 子体不亲和，从而得到远缘杂种。此外，这项技术也为外源特异基因的有性转移、 诱导遗传转化开辟了广阔的应用前景。
• （3）接种培养
• 消毒后的花蕾在无菌条件下，用镊子剥去 花瓣，取花药接种于MS、N6、Nitsch等基 本培养基上，并将花丝、空瘪及受伤花药 剔除。培养温度因不同植物而异，一般在 25～28℃之间。
2）花粉培养
• （1）花药预处理和预培养
• 预处理方法有黑暗处理、光质处理、高渗 处理、药物处理及温度处理等。多采用的 是，取花粉处于合适发育期的花蕾，置于 4～10℃下处理1～15天。花药预培养也是 行之有效的方法，具体是灭菌后的花药置 于甘露醇溶液中，漂浮预培养2～5天，取 出花药后再分离花粉培养；也可在无菌条 件下取出花药，接种于Nitsch等培养基中预 培养数天，然后将花粉分离出来，再进行
• 1）离体子房受精 • 离体子房受精就是将不同发育阶段的子房连同一段花梗，经消毒后，接种在培养
基上，再授以无菌的花粉。花粉可以用不同浓度的硼酸、蔗糖配成花粉悬浮液， 在子房上切一个开口，把花粉悬浮液滴入切口中，也可用注射器直接把花粉悬浮 液注入子房内，最后将子房接种于培养基上进行培养。此技术是一种接近于自然 情况的授粉技术。 • 2）胚珠试管受精 • 为了提高胚珠培养的成活率，通常选用带有胎座的胚珠进行培养。胚珠包裹在 子房内，处于无菌状态，只需子房消毒后直接在无菌条件下把胚珠剥离出来接种 于培养基上进行培养。授粉时可以直接把无菌的花粉撒在胚珠上，也可先将花粉 撒在培养基上，然后把带有胎座的胚珠接种在散播花粉的培养基上进行授粉。
1）成熟胚培养
• （1）成熟胚培养的意义 • （2）材料的消毒与接种 • （3）培养基及培养条件
2）原胚培养
• （1）原胚培养的概念及意义 • （2）材料的选择 • （3）培养基及培养条件
13.1.5 胚乳培养
• （1）胚乳发育期的选择 • （2）胚乳愈伤组织的建立 • （3）培养基与培养条件
• （2）花粉的分离
• 分离小孢子的方法有挤压法、散落法和器 械法三种。无论采用哪种方法，均需得到 一定量的小孢子，且无菌、无杂质，成活 率高，发育整齐等。所谓挤压法就是用玻 璃棒在烧杯壁上挤压花药，使花粉从花药 中释放出来。散落法是把花药接种于液体 培养基上，悬浮培养1～7天，花药自然开 裂，散出花粉，及时取出花药壁，留下花 粉继续培养。器械法是用小型搅拌器或超
13.1.4 胚培养
• 杂种胚由于营养或生理的不协调而导致难 以播种成苗，或在发育早期就败育或退化， 把杂种胚在败育或退化之前直接剥离出来 接种于培养基上进行早期离体培养的方式 叫做杂种胚挽救。离体胚培养可以克服种 间乃至属间受精障碍、打破种子休眠、缩 短育种周期、克服种子生活力低下和自然 不育等，通过成熟胚和未成熟胚离体培养 已获得了不少的园艺植物。
• （2）材料预处理与灭菌
• 在大多数情况下，只有经过预处理的花药 才能培养出完整的单倍体植株。预处理的 方法有低温、高温、离心和预培养等，目 的是要从形态上改变其极性分布，从生理 生化上改变其细胞生理状态，以改变其分 裂方式和发育途径。
• 经预处理后的花蕾，用乙醇进行表面灭菌 后再用次氯酸钠或升汞灭菌后即可接种。
13.1.1 花药与花粉培养技术
• 1）花药培养 • （1）材料的选取 • 植物材料的基因型、生长情况及接种时花粉所处的发育时期对
花药培养有直接影响。从减数分裂期至双核期的花药，均有可 能诱导离体孤雄发育，对多数植物而言，最佳时期是单核中期 至晚期。各种植物花药培养的最佳时期是不同的，可根据花药 内花粉发育期与花蕾大小、外观形态、色泽的相关性来选取材 料。 • 一般采用涂片法来确定花粉发育的时期，用醋酸洋红或卡宝品 红或铁钒-苏木精染色后找出小孢子发育的细胞学指标与该种植 物花蕾发育形态指标的相关性，便于接种取材。