食品微生物检验技术

36±1oC 48± 2h
菌落计数
报告
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四、检验方法（P6） 五、菌落总数测定时的注意事项： 1、固体样品应彻底粉碎； 2、培养基（营养）琼脂必须透明、无杂质； 3、选择好稀释度； 4、培养基温度应在46oC ，不能过烫，否则易把 细菌烫死； 5、培养液中接种菌悬液后，应在半小时内接种 培养基，（时间太长，某些细菌可自动凝集） 培养基和菌悬液必须充分浑匀。
阳性
阴性
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七、甲基红实验（MR实验）和V-P实验 1、MR实验原理：一些细菌分解葡萄糖产生丙 酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、 乳酸和琥珀酸而使培养基的PH值下降到4.5以 下，加入甲基红指示剂出现红色反应
阴性
阳性
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2、V-P实验原理 一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生 乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空 气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内 蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色 化合物。（实验结果同MR实验） 八 、柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验） 一些微生物可以以铵盐作为唯一 的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳 源，在柠檬酸盐培养基上生长，分 解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基 阴性 变成碱性，酸碱指示剂变色。 阳性
菌落总数测定
一、定义：是指食品检样经过处理，在一定条件 下培养后，所得1克或1毫升检样中所含细菌菌 落的总数。 二、原理：样品经稀释后，使样品悬液中的微生 物分散存在，接种一定量到培养基中，充分混 匀。从理论上来说微生物在培养基中分散呈单 个存在，一个菌体长出一个肉眼可见的菌落， 计算菌落数可推出菌体数。
阳性
阴性
五、糖发酵实验 分解糖产酸，PH值下降，使培 养基的酸碱指示剂发生变化。 阳性：产酸产气
阴性
阳性
9
六、氧化发酵实验（O/F实验） 有些微生物分解葡萄糖必须有氧参加，此种细 菌称为氧化型； 有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型； 有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱 型。
灭菌琼脂（厌氧）
一、样品的种类 大样：一整批样品（数量不固定）。 中样：从大样的不同部位取得的混合样品。 小样：从中样取的、供检验用的样品。 二、采样原则：所采集的样品必须有代表性。在采样前 应对食品的原料加工方法运输保藏条件及销售中的各 个环节等进行调查。在调查的基础上采集有代表性的 样品。 三、采样注意事项 1、在无菌操作下进行。 2、采样用具必须是无菌的。 3、所用容器不得含有任何消毒剂、防腐剂抗生素等杀菌 或抑菌物质。 24
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第二节 大肠菌群数测定
一、定义 大肠菌群系指一群在37oC 24h能发酵乳糖、产酸、 产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该 菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来 评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 食品中大肠菌群数系以每100毫升（克）检样内大 肠菌群最可能数（MPN）表示。 二、选择粪便污染指标菌应具备的条件： 1、这种菌在人和温血动物中普遍存在，且数量较多； 2、在水和食品中生存时间与肠道致病菌相当或稍长； 3、在粪便污染的水和食品中容易找到，未污染的水和 食品中不能发现；
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灭菌生理盐水使其溶解即可；含盐量较高的食品直接 解在灭菌蒸馏水中；在室温下较难溶解的食品如奶粉、 奶油、奶酪、糖果等样品应先将盐水加热到45oC后放 入样品（不能高于45oC），促使其溶解；蛋制品可在 稀释液瓶中加入少许玻璃珠，振荡使其溶解；生肉及 内脏应先将样品放入沸水内煮3--5秒或灼烧表面进行表 面灭菌，再用灭菌剪刀剪掉表层，取深度样品25克， 剪碎或研碎制成混悬液。 2、液体样品 1）原包装样品将液体混匀后，用点燃的酒精棉球对瓶口 进行消毒灭菌，用石炭酸或来苏儿（煤酚皂液）等浸 泡过的纱布盖好瓶口，再用消毒开瓶器开启后直接吸 取进行检验。 2）含CO2的液体样品（如汽水、啤酒等）可用上述无菌
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（1）
（2）
（3）
二十一、硫化氢实验 一些微生物分解含硫氨基酸（胱 氨酸或半胱氨酸），产生硫化氢 硫化氢与二价铁盐或铅盐生成黑 色沉淀，使培养基变黑。
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第二章血清学实验
一、抗原、抗体 抗原：能在体内引起免疫反应的物质 抗体：抗原刺激产生的物质 二、血清学试验 抗原与抗体在体外发生的特异性结合反应叫血 清学试验 玻片凝集实验
阳性
阳性
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十七、淀粉酶实验 一些细菌可产生淀粉 酶将淀粉分解为双糖或 单糖，加入碘不变色。 十八、卵磷脂酶实验 一些细菌产生卵磷脂酶， 可以分解卵磷脂产生甘油 脂和水溶性的磷酸胆碱， 在菌落周围形成一个乳白 色的沉淀或浑浊带。
接种菌，可 产生淀粉酶
乳白色 浑浊带 透明圈
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十八、脱氢酶实验 微生物有脱氢酶，可使氯 化三苯四氮唑（TTC)还原， 由无色变为红色。 阳性 十九、三糖铁实验 1、成分：牛肉膏、蛋白胨（氮源） 三糖：葡萄糖0.1%、乳糖1%、蔗糖1% 硫酸亚铁 琼脂 培养基摆成高层斜面 PH值调到7.4
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十三、氨基酸脱羧酶实验 一些细菌可以产生氨基 酸脱羧酶使氨基酸脱酸， 产生胺类物质，使培养基 变碱，酸碱指示剂变色。 阴性 十四、尿素实验 一些细菌可以产生尿素酶， 使尿素分解产生大量的胺， 使培养基变碱，培养基指示 剂变色。
阳性
阳性
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十五、靛基质实验（吲哚实验） 一些细菌可以分解蛋白 胨的色氨酸，产生靛基质， 靛基质可与对二甲氨基苯 甲醛作用，生成玫瑰吲哚 对照 而成红色。 十六、ONPG实验（ 检测-半乳糖苷酶） 邻硝基酚----D半乳糖苷 -半乳糖苷酶 邻硝基酚 + --D半乳糖
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菌落总数测定方法规定的培养条件 下所得结果，只包括一群在营养琼脂上 生长发育的嗜中温性需氧的菌落。 菌落总数主要作为判定食品被污染 程度的标志，也可用于观察细菌在食品 中繁殖的动态，从而对被检样品进行卫 生学评价提供依据。
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三、检验程序：
检样
作成几个适当倍数的稀释液 选择2-3个适宜稀释度 各以1毫升量加入灭菌平皿内 每皿内加入适量琼脂
菌落总数测定 卫生指标菌 大肠菌群测定 沙门氏菌检验 致病菌 志贺氏菌检验 金黄色葡萄球菌检验 溶血性链球菌检验
六、细菌污染食品的途径
1、食品加工原料的污染 2、产、储、运、销过程中的细菌污染 3、从业人员的污染 4、食品加工过程中的污染
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第一章 食品微生物检验中的生理生化实验
设计生化实验的原则：在实验中加入某些 化学物 质，使细菌代谢途径中分解代谢产物与加入的化 学 物质发生反应，产生某些变化或出现某种特征。 一、过氧化氢酶及过氧化物酶实验原理 1、2H2O2 过氧化氢酶 2H2O+O2 阳性 2、过氧化物酶： RH2+H2O2 过氧化物酶 R+2H2O 阳性：细菌变为黑褐色； 阳性 阴性 阴性： 不变色。
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4、对氯的低抗力与肠道致病菌相似； 5、检验方法比较简单，易于检出。 三 、大肠菌群数测定的卫生学意义： 大肠菌群包括：艾希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、 克雷伯氏菌属 新鲜粪便中艾希氏菌属占优势。 1、大肠菌群作为粪便污染指标菌，既包括近期污染又包 括远期污染，具有广泛的卫生学意义，对人的安全保 险系数更大了； 2、测定大肠菌群含量表明食品被粪便污染的程度：如果 菌数含量越多，表明粪便污染越严重，并间接表示有 肠道致病菌污染的可能性。 四、大肠菌群数测定原理
4、据样品的种类如袋、瓶、罐装者，应采取完整未开封 的，若样品包装过大，则用无菌采样器采样。样品为 固体粉沫，应边取边混合；为液体，振摇均匀后再取 样；为冷冻食品，采样后应保持在冷冻状态；非冷冻 食品采样后，应保持在0--5 oC（不能冷冻）. 5、按规定采样数量及方法采集样品量。 6、样品采集后贴好标签、标明品名、来源、数量、地点、 采样者及年月日等必要时可贴封条送检。 7、记录采样现场的温度、湿度及卫生状况。 四、样品的处理 1、固体样品：用灭菌刀、剪、镊子，取不同部位25克， 剪碎，放入灭菌均质器内或乳钵内，加定量灭菌生理 盐水，研碎混匀，制成1：10混悬液。 不同食品混悬液制法不同：一般食品取25克，加225克
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九、丙二酸钠实验 一些微生物可以以丙二酸钠 作为唯一碳源，分解丙二酸钠 生成碳酸钠，使培养基变成碱 性，酸碱指示剂变色。 十、马尿酸盐实验 一些细菌可以水解马尿酸生 成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸 和Fe3+反应生成有色的苯甲酸 盐沉淀。
阴性
阳性
阳性
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十一、明胶液化实验 一些细菌可产生胞外酶，使明胶蛋白分解为氨 基酸,而失去明胶的凝固能力。 十二、苯丙氨酸脱氨酶实验 一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶， 可以脱氨 生成苯丙酮酸，其 与FeCl3反应产生绿色 。
产毒霉菌检验
霉菌毒素测定
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三、食品微生物检验的特点
1、具有法规性 2、检验的范围广 3、杂菌含量多，要检验的菌少。 （1）需要增菌 （2）抑制杂菌 4、检验结果具有数量界限 5、需要采样后尽快检验，快出结果
四、意义：
检出有害微生物，避免食物中毒，避免造成 经济损失。
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五、食品卫生细菌常规检验项目
食品微生物 检验技术
食品科技学院 王雪静
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一、定义
通过一定的实验方法测定食品中的微生 物，特别是致病微生物的数量、种类、 性质，从而判断食品的卫生质量，保证 消费者的身体健康。
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二、食品微生物检验的内容
菌落总数测定
卫生指标菌检验 细菌检验 大肠菌群数测定
致病菌检验
霉菌、酵母菌数测定
真菌检验
Ag+Ab Ag+生理盐水（对照）
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三、血清学实验在食品微生物检验中的应用
1、血清型：是根据微生物抗原构造 的 不同，对微生物进行分类的一种名词 2、在医学检验中可以用已知的抗原测定未知 的抗体，也可用用已知的抗体测定未知的抗原。 3、在食品微生物检验中用已知的抗体测定未 知的抗原。
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第三章 样品的采集处理及送检
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方法开启瓶盖后，将样品倒入无菌磨口瓶中，盖上一 块消毒纱布，开一缝隙轻轻摇动，使气体溢出后再进 行检验。
3）酸性液体食品 ：按上述无菌操作倒入无菌容器内，再 用20%的Na2CO3调节PH值为中性后检验。 3、冷冻食品 1）冰棍儿：用灭菌镊子除去包装纸，将3支冰棍放入灭 菌磨口瓶中，棍留在瓶外，用盖压紧用力将棍抽出或 用灭菌剪刀剪掉棍，放45oC水浴30分钟溶化后立即检 验。 2）冰淇淋：用灭菌勺取出后放入灭菌容器内，待其溶化 后检验。 3）冰蛋：将装有冰蛋的磨口瓶放入流动的冷水中，溶化 后充分混匀检验。
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4、罐头 对罐头先进行密封实验及膨胀实验，观察是否有漏气 或膨胀情况。 若进行微生物检验，先用酒精棉球擦去油污，然后用 点燃的酒精棉球消毒罐口，用来苏水浸泡过的纱布盖 上，再用灭菌的开罐器打开罐头，除去表面，用灭菌 勺或吸管取出中间样品进行检验。 5、调查现场的棉试子涂擦实验 将涂擦过的棉试子放在定量灭菌生理盐水中，在检验 前用力振荡约50次后再进行接种培养。
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黄 PH<6 指示剂酚红 砖红色 PH=7(大约） 红色 PH>7 2、接种（1）穿刺接种 （2）斜面划线接种 36oC培养18--24小时 3、观察结果 （1）分解葡萄糖、乳糖、蔗糖： 斜面产酸变为黄色（阳性）， 底层产酸变为黄色（阳性）
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（2）分解乳糖、蔗糖，不分解葡萄糖： 斜面、底层都产酸变为黄色（阳性） （3）分解葡萄糖、不分解乳糖、蔗糖： 斜面：产碱显红色 （阴性） 底层：产酸显黄色 （阳性） （4）分解含硫氨基酸 产硫化氢 硫化氢与Fe2+生成黑色沉淀，培养基变黑 （FeS） （5）分解糖类产气，培养基中有气泡。
大小分5cm2、1cm2等 （规板）
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五、样品的送检 样品送到微生物检验室应越快越好， 一般不超过 3h 如果路途遥远，可将不需冷冻的样品保 持在1--5oC环境 中（如冰壶）。如需保 持冷冻状态，则需保存在泡沫 塑料隔热 箱内（箱内有干冰可维持在0 oC以下）。
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第四章
第一节
卫生指标菌检验
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二、细胞色素氧化酶实验原理
细胞色素C 细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素C +对苯二胺 + --奈酚 靛酚兰（蓝色） 阳性： 2分钟内生成蓝色为阳性； 阴性：无变化。
阳性
阴性
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三、氰化钾实验
阳性： 不抑菌， 变混浊 阴性：抑菌
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四、硝酸盐还原实验原理 KNO3 还原酶 KNO2 KNO2+对氨基苯磺酸+ -萘胺 红色化合物 （立刻或数分钟内）