真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)

真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。

Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。

原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。

自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。

并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。

随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。

利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。

在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。

该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。

其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。

但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及;③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。

昆虫表达系统

昆虫杆状病毒表达系统的分子基础
• 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (Ac MNPV)、家蚕核多角体病毒(BmNPV)、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒 (OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( Ld MNPV)、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒( Se MNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)以及斜纹夜蛾核型多角体病毒( SplM t NPV) 杆状病毒在其生活史中共有两种形式的表型存在,在感染的初期( 0~ 24h), 主要以细胞释放型病毒粒子( cell-released virus , CRV)为主, 也称为胞外型病毒 ( extracel lular vir us , ECV)或出芽型病毒 ( Budded vir us , BV); 在感染的晚期主要以包埋型病毒( occlude d vir us , OV)的形式存在。杆状病毒的这两种表型的形态、蛋白组成、病毒囊膜的来源、感染组织特异性以及病毒入侵宿主细胞的方式都不相同。由于两种表型的病毒在结构组成上的差异, 所以杆状病毒在不同的时期需要表达不同类型的蛋白来满足病毒颗粒不同形式的组装。昆虫杆状病毒的基因表达共分为 4个时期: 极早期、早期、晚期、迟晚期。4个时期的基因一环扣一环,按时间先后, 以级联方式严格制约。早期表达的基因有 ie- 1、 me53、 pe38、 ie- 2等, 晚期表达的基因有 vp39 、vp80、 polh、 p10等, 这些不同的基因所表达的蛋白各自具有不同的功能, 有些表达产物具有调控的功能, 而有些仅仅只具有结构蛋白的作用。在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病毒基因组复制所非必需, 其中最具代表性的有多角体蛋白与 P10蛋白, 均属于晚期表达的蛋白,受晚期启动子的调控。昆虫的杆状病毒表达系统正是利用了这类蛋白的优点, 从而提供了外源 DNA插入座位。

真核表达载体

真核细胞常见表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

基因工程中常用载体及其主要特点

基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。

今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。

简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。

它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。

这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。

没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。

想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。

质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。

质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。

想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。

质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。

这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。

噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。

它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。

想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。

2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。

2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。

这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。

真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。

它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。

举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。

载体选择

1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

几种表达载体

表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD载体:特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。

请注意:1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。

同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。

2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。

本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域SDP BAD….TACCCGTTT TTTTCC….GCTAG CAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGTA M A E LTTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 Pst1 Hind111(b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1P BAD….TACCCGTTTTTTTGG….GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1 Sac1 Smal 1 Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2. pCAl-n & pCAl-pelB载体特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。

真核表达载体

常用的哺乳动物细胞表达载体和组成成分有SV40病毒表达载体、痘病毒表达载体、逆转录病毒表达载体，常见的哺乳动物表达载体的组成成分有：原核DNA序列、启动子、增强子、拼接信号、终止信号和多聚腺苷酸化信号、筛选标记及真核病毒序列等。

(1)原核DNA序列：为了能在大肠杆菌中增殖，得到大量能转染哺乳动物细胞的重组DNA，哺乳动物表达载体中通常有一段原核序列，包括一个能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于挑选含重组DNA细菌的抗生素抗性基因，以及便于把真核序列插入载体的少数单一限制性酶切位点。

当具备这些序列以后，外源的真核基因序列可由单一酶切位点插入载体中，形成的重组DNA可在大肠杆菌中增殖，经抗生素筛选后进行DNA提取，即可得到大量的所需的哺乳动物细胞表达载体。

(2)启动子：真核生物的启动子区域位于TATA区上游100bp到230bp之间，TAT区位于转录起始点上游25-30bp处。

启动子的转录效率因细胞而异。

因此需根据宿主细胞类型选择不同的启动子。

(3)增强子：增强子是使启动子的基因转录效率显著提高的一类顺式作用元件，有多个独立核苷酸序列组成。

它们的作用通常不具有方向性，在位于转录起始点的下游或离启动子很远时仍有活性。

许多增强子只能在特定的组织或细胞中起作用，即具有组织细胞的特异性，因此在构建真核表达载体的时候，应根据宿主细胞来选择增强子。

(4)剪接信号：真核基因由许多内含子和外显子组成。

被转录成mRNA前体以后，需通过剪除内含子、连接外显子才能成为成熟的mRNA。

一般mRNA拼接需要的基本序列位于内含子的5’和3’末端，因此，改变拼接位点5’和3’末端两侧的外显子序列可能会影响邻近拼接位点的使用效率，在替换外显子时应注意。

(5)终止信号和多聚腺苷化的信号：转录的终止信号常常位于多聚腺苷化位点下游的一端长度为几百个核苷酸碱基的DNA区域内。

多聚腺苷化需要两种序列：位于腺苷化位点下游的GU丰富区或U丰富区和位于腺苷化位点上游11-30个核苷酸处的一个有6个核苷酸碱基组成并高度保守的AAUAAA序列。

基因工程原理与技术-3

pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签：多聚组氨酸残基、结合麦芽糖蛋白、谷胱甘肽-s-转移酶。
亲和层析法纯化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的杀伤质粒)。
提取的质粒有三种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线形DNA。
2、质粒的复制类型严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。

真核细胞常见表达载体

真核细胞罕睹表黑载体之阳早格格创做真核细胞, 表黑载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特性:该真核细胞表黑载体分子量为6600碱基对于，主要由CMVp开用子、兔β-球蛋黑基果内含子、散腺嘌呤、氨青霉素抗性基果战抗neo基果以及pBR322骨架形成，正在大普遍真核细胞内皆能下火稳牢固天表黑中源手段基果.更要害的是，由于该真核细胞表黑载体中抗neo基果存留，转染细胞后，用G418筛选，可修坐宁静的、下表黑手段基果的细胞株.拔出中源基果的克隆位面包罗Sal1、BamH1战EcoR1位面.注意正在此载体中有二个EcoR1位面存留.2、pEGFP, 巩固型绦色荧光蛋黑表黑载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特性: pEGFP表黑载体中含有绿色荧光蛋黑，正在PCMV 开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗性基果正在大肠杆菌中的表黑.用途: 该表黑载体EGFP上游有Nde1、Eco47111战Age1克隆位面，将中源基果扦进那些位面，将合成中源基果战EGFP的混合基果. 借此可决定中源基果正在细胞内的表黑战/或者构造中的定位.亦可用于检测克隆的开用子活性(与代CMV开用子,Acet1-Nhe1).3、pEGFT-Actin, 巩固型绿色荧光蛋黑/人肌动蛋黑表黑载体特性:pEGFP-Actin表黑载体中含有绿色荧光蛋黑战人胞浆β-肌动蛋黑基果，正在PCMV开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗性基果正在大肠杆菌中的表黑.用途: pEGFP-Actin载体正在真核细胞表黑EGFP-Actin混合蛋黑，该蛋黑能调整到胞内正正在死的肌动蛋黑，果而正在活细胞战牢固细胞中瞅察到细胞内含肌动蛋黑的亚细胞结构.4、pSV2表黑载体特性：该表黑量粒是以病责SV40开用子启动正在真核细胞手段基果举止表黑的，克隆位面为Hind111.SV40开用子具备构造/细胞的采用特同性.此载体没有含neo基果，故没有克没有及用去筛选、修坐宁静的表黑细胞株.5、CMV4 表黑载体特性:该真核细胞表黑载体由CMV开用子启动，多克隆天区酶切位面采用性较多.含有氨苄青霉素抗性基果战死少基果片段以及SV40复造本面战fl单链复造本面.但是值得注意的是，该表黑载体没有含有neo基果，转染細胞后没有克没有及用G418筛选宁静的表黑细胞株. 其余时常使用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ugpUC18 DNA 25 ugpUC19 DNA 25 ug证明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体符合于DNA片段的克隆、DNA测序战对于中源基果举止表黑等.那些载体由于正在lacZ基果中含有多克隆位面，当中源DNA片段扦进，转移lacZ基果缺累细胞，并正在含有IPTG战X-gal的培植基上培植时，含有中源DNA载体的细胞将为红色菌降，而无中源DNA片段载体的细胞则为兰色菌降，由此易于筛选有无中源DNA片段的载体.别的，那些载体中有便于测序的M13、T7战T3的通用引物举止DNA测序. 保存液: TE BufferTE Buffer组成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1mM EDTA用途: 克隆中源DNA片断. 举止基果表黑. 使用M13、T7战T3引物举止测序. 存留的问题细胞的死命活动是一个搀纯的调控历程，有些死命活动的机理还没有真足浑晰，由于插人的手段基果分歧，载体构修栗用的逆式组件分歧，组拆的空间位子分歧，采与的表黑系统分歧，手段基果表黑火仄易阳性克隆筛选率皆市有很大好别.其余，由于所有的逆式元件存留种属战构造特同性，所构修的下效表黑载体纷歧定正在所有细胞株中均下效表黑.再者，细胞死少状态的好别，转染要领的分歧培植时阉的少短，筛选药物浓度的下矮，对于表黑量皆有很大效率.所以，需要概括评介一个表黑载体战表黑系统，排除一些没有定果素，筛选出最好拉拢真核表黑载体趋背于既有好处扩删手段基果又有好处筛选阳性克隆的载体的构修.许多灵验的应用范畴广的强开用子战巩固子被人创造并应用于载体中，大大普及了手段基果的表黑量，其余一些强的组成型开用子，如SV40早期开用子+PHTLv，已应用于大规模死产的细胞系中. 应用以GS为筛选标记的表黑载体可兼有筛选战扩删手段基果二种功能，是暂时钻研的沉面.以IRES连交的单逆反子表黑载体已成为核表黑载体的主体.正在共一开用子把持下，筛选基果或者报告基果与手段基果转录正在共一mRNA上通过IRES的效率，表黑出二种蛋黑，果而正在表面上可认为，通过了筛选或者表黑了报告基果的克隆必为阳性克隆，即表黑手段基果的克隆，有报导道那种单逆反子的共表黑率为90％.那便大大普及了筛选率，简化了真验历程. 将强开用子、巩固子战可扩删的筛选标记组拆正在共一载体上，构修下效表黑战筛选的表黑载体并将其使用于最符合的表黑系统中，是现正在真核表黑载体构修钻研死少目标.。

真核细胞表达系统

真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。

简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。

1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。

甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。

甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。

大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。

甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。

2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。

杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。

杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。

目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。

与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。

3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。

虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。

哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。

7第七章：真核生物的克隆载体

TRP1和复制起点。
特定克隆实验中三种酵母克隆载体选择哪一种，从下面3个因素考虑：
• 1、转化效率（transformation frequency) ：即用每微克的质粒DNA可以获得的转化体的数目。
YEp:10,000-100,000个（转化的细胞/每微克质粒DNA） YRp:1000-10,000个 YIp: 小于1000个
7.1.6
7.1.6 其他酵母和真菌的载体
除酿酒酵母外，其他酵母和真菌的基础分子生物学
研究还需要其他相应的克隆载体。目前在丝状真菌
基因工程中广泛使用的载体系统主要是整合型质粒
和自主复制型质粒两大类。
在多数情况下，整合型质粒（相当于YIp）能够更好
地满足生物技术领域的需要，它们可以提供稳定的
重组体，可以在生物反应器中长时间地生长。
酵母游离型质粒，YEp13
为什么人们要构建这样一种穿梭载体？
• 原因之一是很难完整地把重组DNA从转化后的酵母菌落中取出来。而对YEp来说不存在问题，因为 YEp在酵母细胞中主要以质粒形式存在；但是对一些把自己整合到酵母染色体上的载体来说，要想从酵母细胞中提纯重组的DNA简直是不可能的。可是，在有些克隆实验中，必须提纯重组后的DNA，进行测序，以判断重组体是否已经正确构建。
3) 复制起始位点：与质粒的复制起点功能一样，是染色体DNA复制的起始位置。
染色体结构确定后，可以通过重组DNA技术将染色体的每一个组成部分分离开来，然后再连接在一起，创造人工染色体。自然存在的酵母染色体有几百个kb的长度，利用人工染色体可以携带比其他质粒载体携带的更大的DNA分子。
YAC载体的结构和用途
质粒与C.S LEU2基因间的重组可以将YEp13整合进酵母

分子生物学：真核生物表达系统

人延长因子1基因人巨细胞病毒立早基因劳斯肉瘤病毒LTR 猿猴病毒40晚期基因猿猴病毒40早期基因腺病毒主要晚期启动子小鼠β－珠蛋白基因
40～160 4 2 1.1 1 0.4 0.2
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（2）多聚腺苷酸化信号（加尾信号）：所有真核细胞mRNA3ˊ末端都具有Poly(A)结构，多腺苷酸化信号一般由位于多腺苷酸化位点上游11～30核苷酸的保守序列AAUAAA 和一个下游的GU或U富含区组成，
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(4)复制子：哺乳动物基因表达载体的复制子一般采用病毒基因组的复制子，由于某些病毒可以在哺乳动物宿主细胞内进行自主复制。不同的病毒复制子的工作效率不同，常用于构建哺乳动物表达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛乳头瘤病毒等的复制子。
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1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、表达出来的蛋白质不能有效、正确的折叠及二硫键配对错误 3、缺乏信号肽切除、糖基化、磷酸化和羧化等翻译后修饰以及对原核细胞有毒性。
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一、真核细胞表达宿主的种类及优势
不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较大肠杆菌产率蛋白酶消化
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pCMV-HA：为Clontech公司产品，该质粒载体含CMV启动子，在CMV 下游的内含子为晚期SV40 19S mRNA内含子及SV40 16S mRNA内含子，在N端有血凝素(HA)表位标签和氨基苄青霉素抗性基因选择标记。
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病毒感染转染
化学法
物理法

生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍

生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍真核细胞是一类具有细胞核的生物细胞，可以分为植物细胞和动物细胞。

在生物制药技术中，真核细胞表达系统被广泛应用于生产重组蛋白和制造药物。

真核细胞表达系统是指利用真核细胞作为宿主细胞的技术平台，通过转染或转化等方式将外源基因导入真核细胞，使其在真核细胞内表达特定的目标蛋白。

这种技术具有许多优势，包括蛋白质修饰、折叠和活性组装等方面的能力，能够确保生产的蛋白质具有更高的完整性和生物活性。

在真核细胞表达系统中，植物细胞和动物细胞被广泛用于生产不同类型的蛋白质药物。

植物细胞表达系统具有成本低、易于大规模培养和改造灵活等优势。

植物细胞能够进行正确的蛋白质修饰，如糖基化、磷酸化和亚硫酸酯化等，同时它们不含病原微生物，减少了潜在的传染风险。

相比之下，动物细胞表达系统则更适用于生产复杂蛋白质，如单克隆抗体和重组血液因子。

动物细胞能够进行更为复杂的蛋白质修饰，如甘露糖、胆固醇和酰基化等，从而更好地模拟人体内的蛋白质合成过程。

在真核细胞表达系统中，转染或转化是将外源基因导入宿主细胞的关键步骤。

转染是指将外源DNA通过化学物质或物理方法直接导入细胞，如利用电穿孔技术、离子复合物、脂质体或聚乙烯亚胺等。

而转化则是指通过细菌质粒或病毒载体将外源基因导入宿主细胞。

转化技术包括病毒载体介导转化、细菌质粒介导转化和转座子系统介导转化等。

一旦外源基因成功导入宿主细胞，其表达需要依赖于启动子、增强子、转录因子和调控序列等元件。

一般而言，真核细胞表达系统中最常用的启动子是多聚腺苷酸酸（polyadenylation signal）和转录因子结合位点（transcription factor binding sites）。

增强子（enhancer）可以增强启动子的活性，从而提高外源基因的表达水平。

除了基因导入和表达的技术要求，真核细胞表达系统还需要注重生物反应器的选择和细胞培养条件的优化。

对于植物细胞表达系统，传统的反应器选择包括大型容器培养（如发酵罐）和搅拌型生物反应器。

真核载体的应用和原理

真核载体的应用和原理简介真核生物是指细胞内含有真核细胞核的生物，包括动植物、真菌等。

真核生物的细胞包含多个细胞器，如细胞核、线粒体等。

对于研究真核生物的基因功能和表达调控，研究人员常常利用真核载体作为工具进行基因转染和表达。

本文将介绍真核载体的应用领域和基本原理。

应用领域基因转染真核载体可以用于将外源基因导入真核生物细胞中，通过基因转染可实现以下应用： - 基因功能研究：通过敲除或过表达外源基因，研究其对细胞和生物体的影响。

- 蛋白质表达：利用真核载体实现外源蛋白质在真核细胞中的高效表达。

- 基因治疗：将治疗基因导入患者体内，用于治疗一些遗传性疾病等。

转基因生物研究真核载体也被广泛应用于转基因生物研究，通过在真核生物细胞中导入外源基因，研究人员可以： - 验证基因功能：通过外源基因的表达，研究其在生物体中的功能和调控。

- 制备抗体：将外源蛋白表达在真核细胞中，制备特异性抗体，用于蛋白质识别和研究。

基本原理选择适合的真核载体在进行基因转染实验时，选择适合的真核载体非常重要。

常用的真核载体有：- 原核真核双操作子表达载体：这种载体结构合理，适合真核生物的表达。

- mama 单元载体：这类载体包含起始子，终止子，选择子，选择子较为灵活。

载体构建和转染技术为了实现外源基因的转染，通常需要进行以下步骤：1. 基因克隆：将外源基因插入载体中，构建重组载体。

2. 载体扩增：利用细菌进行大量的载体扩增。

3. 纯化载体DNA：纯化扩增后的载体DNA，去除可能存在的杂质。

4. 细胞培养：培养要转染的真核细胞，使其进入合适的状态。

5. 转染：将纯化的载体DNA导入培养的真核细胞中，实现外源基因的表达。

表达调控真核载体的应用还包括对外源基因的表达调控，研究人员通过改变载体中的启动子、转录因子结合位点等元件，可以实现基因的定量、定位和时序调控。

成果分析在转染后，需要进行相关结果的分析以验证实验效果。

常用的方法包括： - 蛋白质表达分析：通过免疫印迹法或荧光染色等技术，检测外源蛋白的表达情况和定位。

基因工程课件14 真核表达系统

单交换整合
双交换整合：置换，稳定性强
a.基因取代或基因删除 b.稳定型表达元件的整合
二、酵母表达系统

附加体型载体

大肠杆菌质粒，2μm质粒，酵母染色体选择标记基因构成。

2μm 提供复制起始点和STB，使载体更稳定
拷贝数高
用于外源基因的表达
二、酵母表达系统

可以通过哪些方法增加质粒载体在酵母宿主细胞中的稳定性，各有什么特征？
GGU (Gly/G)甘氨酸 GGC (Gly/G）甘氨酸 GGA (Gly/G）甘氨酸 GGG (Gly/G）甘氨酸
二、酵母表达系统

自主复制型质粒载体

定义：在E.coli质粒载体的基础上构建而来复制方式：酵母基因组复制起始区,大肠杆菌质粒复制起始序列筛选标记： E.coli +酵母克隆位点来自E.coli质粒转化率高、拷贝数高、不稳定
二、酵母表达系统

酵母人工染色体

ARS：酵母染色体自主复制序列

TEL：端粒序列 CEN：着丝粒选择标记基因
适合真核基因组的克隆与表达研究
酵母表达系统

酿酒酵母， 1981 年 Hitzeman 等用酿酒酵母成功地
表达了人干扰素，但该系统具有一定的局限性，缺乏强有力的启动子，分泌效率差，质粒不稳定等。因此，人们在此基础上又寻找了新的酵母表达系统——毕赤酵母，即甲醇营养型表达系统。

真核选择标记基因

cycloheximide 放线菌酮：由产生放线菌酮的放线菌发酵液中提得的一种抗生素 ,cycloheximide 机理是真核细胞蛋白合成抑制剂,毒性很强，现在已很少用。

MBP不同cDNA序列真核表达载体的构建及鉴定

MBP不同cDNA序列真核表达载体的构建及鉴定目的以pEGFP-N1质粒载体为介导，构建针对髓鞘碱性蛋白（MBP）不同isoform cDNA的表达载体。

方法将三段不同MBP cDNA序列克隆入pEGFP-N1质粒，转化DH5α感受态细胞，酶切鉴定及测序。

结果测序结果显示插入的三段目的片段的序列与理论序列一致。

结论笔者成功构建了pEGFP-N1-MBP21.5，pEGFP-N1-MBP18.5和pEGFP-N1-MBP17.3三个重组真核表达载体，为进一步研究不同MBP cDNA在真核细胞中的表达情况和功能差异奠定基础。

标签：MBP cDNA；真核表达；pEGFP-N1质粒；载体构建髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）是脊椎动物中枢神经系统少突细胞和周围神经系统雪旺细胞合成的一种膜蛋白，含有多种碱性氨基酸，为髓鞘的构成蛋白。

MBP对人脑发育、神经细胞分化、髓鞘发生与髓鞘形成具有重要生理作用[1]。

1962年，Laatsch RH等[2]首先从豚鼠脑中分离出MBP，随后国内外学者在生理、生化及分子水平上对MBP进行了广泛而深入的研究。

人和鼠的MBP基因均位于第18号染色体远端即18q22～23，跨度32～34Kb，含有7个外显子。

人脑中有21.5，20，18.5，17.3和14kDa等mRNA拼接产物，除21.5kDa外，其余缺失外显子Ⅱ、Ⅲ或Ⅵ，成人髓鞘中18.5kDa MBP含量最高[3-7]。

1材料与方法1.2.3连接及转化线性载体与目的片段序列用T4DNA ligase，4℃连接过夜，CaCl2法制备转化大肠埃希菌感受态细胞DH5α，涂布于卡那抗性LB平板，37℃恒温培养箱培养过夜。

1.2.4质粒筛选及鉴定挑选克隆，提取质粒（按TaKaRa公司说明书），Hind Ⅲ和SalⅠ双酶切鉴定挑选阳性重组子，上海生工公司测序。

2结果2.1MBP cDNA PCR扩增结果2.3质粒测序结果3讨论3种MBP cDNA的表达在不同组织细胞和发育阶段中，具有较大差异。

表达载体之原核VS真核

酿酒酵母表达系统常用启动子
1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：
甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH
磷酸甘油激酶基因PKG
乙醇脱氢酶基因ADH
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL8
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL1
A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因甲醇酵母系统的整合事件胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目最适温度毕赤酵母 30℃ 汉森酵母 37℃
最适pH值
甘油阻遏糖基化高密度发酵
4.5
是部分过度 100g/L
4.5
否较正常 100g/L
二大宿主系统主要选择标记
表达载体之原核真核
VS 万佩
原核真核
都原是核我表们达表体达系重与组真基核因表蛋达白体的系重，要亦载如体阴，阳也，各相有辅优相劣成
目的基因
构建
转化
培养，诱导表达载体重组载体表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
常见启动子 λpL启动子： trp启动子： trc启动子：热诱导启动子化学诱导启动子 trp+lac杂交启动子
（一）酿酒酵母表达系统
酿酒酵母系统启动子酿酒酵母分泌系统酿酒酵母糖基化系统酿酒酵母表达系统存在的问题
1、酿酒酵母启动子
起始位点 mRNA
40-120bp
DAS
编码序列
UAS

真核细胞常见表达载体

1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个Ec oR1位点存在。

2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent ProteinVecto r)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及H SV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途:该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

3、pEGFT-Actin,增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达S V40 T抗原的真核细胞内进行复制。