固相萃取_C_30_RPLC法测定南极磷虾油中的虾青素_孙来娣
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
3. Key Laboratory for Sustainable Utilization of Marine Fisheries Resources, Ministry of Agriculture, Qingdao 266071, China)
Abstract：An HPLC method for the determination of astaxanthin isomers in Antarctic krill oil was established following
※分析检测
食品科学
2013, Vol.34, No.08 159
87%)，丙酮-正己烷(4:1)次之(约为85%)，其他几种混合溶 剂洗脱效果相当，加标回收率均低于80%。由于丙酮极易 挥发，洗脱液中的丙酮比例越大操作越难控制，因此实验 选择正己烷-丙酮-甲醇(1:2:2，V/V)作为最佳洗脱溶剂。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 南极磷虾油样品由黄海水产研究所提供。 丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷
和叔丁基甲基醚均为色谱纯；虾青素标准品(纯度大于 95%) 德国Dr. Ehrenstorfer 公司。
1100高效液相色谱仪(配紫外检测器) 美国Agilent 公司；KQ-300E超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公 司；SPE萃取装置 美国Supelco公司；N-EVAP112氮吹 仪 美国Organomation公司；Supelclean LC-NH2固相萃 取小柱(500mg，3mL)。 1.2 方法 1.2.1 样品前处理
通过在南极磷虾油样品中添加虾青素标准品(添加水 平为1.0mg/g)，LC-NH2固相萃取小柱经乙腈-甲苯(3:1， V/V)活化后，上样、洗脱。考察了不同洗脱溶剂对LCNH2小柱的洗脱效果，实验结果如图1所示。
由图1可知：以混合溶剂正己烷-丙酮-甲醇(1:2Βιβλιοθήκη Baidu2， V/V)为洗脱溶剂，其虾青素的加标回收率达到最高(约为
(1. Medical College, Qingdao University, Qingdao 266021, China； 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China；
mL. Quantification was performed by external standard method. Average recovery rates of astaxanthin isomers from spiked
samples varied from 86.1% to 94.3% with RSD between 0.79% and 1.91%. Our results suggest that the developed method is
Determination of Astaxanthin in Antarctic Krill Oil by C30 Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography with Solid-Phase Extraction
SUN Lai-di1，LENG Kai-liang2，SUN Wei-hong2，ZHAO Xian-yong3，GAO Hua1，XING Li-hong2，LIU Kun1,*
(EPA、DHA)、虾青素、VA等生物活性成分[1-4]。其中的
更为活跃，生物利用效价更高[9]。因此研究测定南极磷虾
虾青素是目前公认的抗氧化性能最强、安全性好的生物 油中的虾青素具有重要意义。
活性物质[5-6]。Maoka等[7]研究发现，南极磷虾中的虾青素
虾青素属于弱极性化合物，能否将非极性的油脂与
solid-phase extraction (SPE). Following clean up on LC-NH2 solid-phase extraction column, saponification of the extracted compounds was achieved with NaOH-methanol. Subsequent separation was performed on YMC-Carotenoid C30 column with n-hexane-acetone-methanol (1:2:2) as eluent at a flow rate between 2 and 4 mL/min. Injection volume was set at 8
158 2013, Vol.34, No.08
食品科学
※分析检测
需将其中的虾青素酯转化成游离态的虾青素才能定量测 定[10]。油脂若去除不彻底就必然需要提高皂化反应的加 碱量，致使虾青素被不同程度地氧化破坏；同时大量的油 脂也会对色谱柱和仪器带来污损。传统的去油方法大多采 用溶剂萃取而达到预分离目的，但是此方法操作较繁琐、 有机溶剂耗量大且虾青素在处理过程中易损失[11]。固相萃 取技术近年来在样品前处理过程中已得到广泛应用，该 技术能够较好的富集和预分离目标物，适合于批量产品 的高效快速检测[12-13]。本实验在前人的研究基础上，通过 LC-NH2固相萃取小柱对南极磷虾油中的虾青素进行净化 处理，经NaOH-甲醇液皂化处理后，采用C30-反相高效液 相色谱法测定其中的虾青素。
※分析检测
食品科学
2013, Vol.34, No.08 157
固相萃取-C30-RPLC法测定南极 磷虾油中的虾青素
孙来娣1,2，冷凯良2，孙伟红2，赵宪勇3，高 华1，邢丽红2，刘 坤1,*
(1.青岛大学医学院，山东 青岛 266021；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 3.农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室，山东 青岛 266071)
of high reproducibility and recovery and suitable for the analysis of astaxanthin in Antarctic krill oil. Key words：Antarctic krill oil；astaxanthin；solid-phase extraction；C30-reversed phase high performance liquid chromatography
1.2.3 色谱条件[14] 色 谱 柱 ： Y M C - C a r o t e n o i d C 30色 谱 柱
(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；检测器：紫外波 长为474nm；进样量：20μL；流速：1.0mL/min；流动 相：A甲醇，B叔丁基甲基醚，C1%磷酸溶液；梯度洗 脱程序为：0～15min，81%～66% A，15%～30% B， 4% C；15～23min，66%～16% A，30%～80% B，4% C；23～27min，16%～81% A，80%～15% B，4% C； 27～30min，81% A，15% B，4% C。 1.2.4 样品中虾青素3种同分异构体的组成分析
式中：As、Cs分别为全反式虾青素标准工作液的 峰面积和含量；A13-cis、A 、 trans A9-cis、分别为试样溶液中 13-顺虾青素、全反式虾青素、9-顺虾青素的峰面积； 1.3、1.1分别为13-顺虾青素和9-顺虾青素对反式虾青素 的校正因子；m为样品质量；V为试样溶液体积；f为稀 释倍数。
中图分类号：TS254.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630(2013)08-0157-04
南极磷虾油是从南极磷虾中提取得到的深红色黏 以双酯形式存在[8]。双酯型虾青素由于具有更强的亲脂
稠状油脂，含有丰富的磷脂、Omega-3多不饱和脂肪酸 性，其比单酯或游离虾青素更易疏水，在肠道中的吸收
收稿日期：2012-06-11 基金项目：国家“863”计划项目(2011AA090801) 作者简介：孙来娣(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为天然活性物质提取及分析测定。E-mail：sunlaidi1003@163.com *通信作者：刘坤(1962—)，女，教授，研究方向为天然活性物质提取及分析测定。E-mail：kunliu62@yahoo.com.cn
准确称取虾青素标准品10mg，用丙酮溶解并定容于 50mL棕色容量瓶中，得到质量浓度为0.2mg/mL的标准储 备液，充氮密封，置－18℃冰箱中避光保存，有效期1个 月。使用前将储备液用二氯甲烷-甲醇(1:3，含1% BHT) 稀释，配制成适量浓度的标准工作液，所有标准工作液 均需充氮密封，置4℃条件下避光保存，有效期1周。
266071；
摘 要：建立用固相萃取预分离、测定南极磷虾油样品中虾青素3种同分异构体的高效液相色谱法。样品经固相萃 取小柱预分离净化，加NaOH-甲醇溶液皂化反应后，经YMC-Carotenoid C30色谱柱分离得到虾青素3种同分异构体， 采用外标法定量。南极磷虾油中虾青素的最佳净化条件为：以LC-NH2为固相萃取小柱，正己烷-丙酮-甲醇(1:2:2， V/V)为洗脱溶剂，洗脱体积为8mL，洗脱流速控制在2～4mL/min。样品经LC-NH2固相萃取小柱净化后平均添加回 收率为86.1%～94.3%，相对标准偏差为0.79%～1.91%。结果表明，方法重现性好，回收率高，适用于南极磷虾油 中虾青素含量分析。 关键词：南极磷虾油；虾青素；固相萃取；C30-反相高效液相色谱法
同雨生红球藻一样，都是以游离虾青素、虾青素单酯、 弱极性的虾青素有效的分离净化，这对后续虾青素的皂
虾青素双酯3种形式存在；所不同的是雨生红球藻中的虾 化反应及测定显得尤为重要。由于南极磷虾中的虾青素
青素主要以单酯形式存在，而南极磷虾中的虾青素主要 主要以双酯和单酯形式存在，采用C30-HPLC进行测定时
2 结果与分析
2.1 固相萃取条件考察 2.1.1 固相萃取小柱的选择
由于虾青素极易受外界环境的干扰，其在酸性或碱 性条件下都不稳定。为了使样品得到有效的净化，实验 考察了LC-NH2、WAX、WCX、C18、中性氧化铝、硅 胶等固相萃取小柱的净化效果。结果发现硅胶对虾青素 的净化效果不明显且所需洗脱溶剂量大，给目标物的浓 缩带来麻烦；中性氧化铝虽能较好的分离目标物，但实 验的洗脱条件需在酸性环境下进行，致使虾青素结构破 坏；而WAX、WCX主要用于分离酸性或碱性化合物，因 此也不适合虾青素的分离；用C18柱的加标回收率虽然能 达到80%，但油脂也不可避免地洗脱下来；相对于C18柱 而言LC-NH2柱的净化效果更佳，回收率在85%左右。因 此实验最终选择LC-NH2固相萃取小柱净化。 2.1.2 洗脱剂的选择
分析和计算方法：取皂化好的样品进行C30-RPLC分 析，外标法定量。由于13-顺虾青素和9-顺虾青素标准品 价格十分昂贵且难以获得，因此本实验虾青素的定量以 全反式虾青素为参照，其具体计算公式按下式进行[14]：
X = (1.3 × A13-cis + A tra + 1.1× A9-cis ) × Cs ×V × f As × m
样品测定前需先经固相萃取小柱预分离，然后进行 皂化反应得到待测液。固相萃取：准确称取1.0g南极磷 虾油样品于25mL容量瓶中，用正己烷-丙酮(1:4，V/V)溶 解并定容至刻度。准确移取2mL上述待测样品溶解液于 预活化好的小柱中，收集洗脱液于5mL容量瓶中，35℃ 以下氮吹至近干，加入约2mL二氯甲烷-甲醇溶液(1:3， 含1% BHT)，待用。皂化反应：向上述待用样液中准确 加入0.1mol/L的NaOH-甲醇溶液1mL，涡旋混合，充氮 密封，在4℃冰箱中反应12～14h，于皂化反应液中加入 0.4mL 2%的磷酸甲醇溶液中和剩余的碱，用二氯甲烷-甲 醇(1:3，含1% BHT)定容，涡旋混合后过0.45μm微孔滤 膜，供HPLC检测分析。 1.2.2 标准溶液的配制
Abstract：An HPLC method for the determination of astaxanthin isomers in Antarctic krill oil was established following
※分析检测
食品科学
2013, Vol.34, No.08 159
87%)，丙酮-正己烷(4:1)次之(约为85%)，其他几种混合溶 剂洗脱效果相当，加标回收率均低于80%。由于丙酮极易 挥发，洗脱液中的丙酮比例越大操作越难控制，因此实验 选择正己烷-丙酮-甲醇(1:2:2，V/V)作为最佳洗脱溶剂。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 南极磷虾油样品由黄海水产研究所提供。 丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷
和叔丁基甲基醚均为色谱纯；虾青素标准品(纯度大于 95%) 德国Dr. Ehrenstorfer 公司。
1100高效液相色谱仪(配紫外检测器) 美国Agilent 公司；KQ-300E超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公 司；SPE萃取装置 美国Supelco公司；N-EVAP112氮吹 仪 美国Organomation公司；Supelclean LC-NH2固相萃 取小柱(500mg，3mL)。 1.2 方法 1.2.1 样品前处理
通过在南极磷虾油样品中添加虾青素标准品(添加水 平为1.0mg/g)，LC-NH2固相萃取小柱经乙腈-甲苯(3:1， V/V)活化后，上样、洗脱。考察了不同洗脱溶剂对LCNH2小柱的洗脱效果，实验结果如图1所示。
由图1可知：以混合溶剂正己烷-丙酮-甲醇(1:2Βιβλιοθήκη Baidu2， V/V)为洗脱溶剂，其虾青素的加标回收率达到最高(约为
(1. Medical College, Qingdao University, Qingdao 266021, China； 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China；
mL. Quantification was performed by external standard method. Average recovery rates of astaxanthin isomers from spiked
samples varied from 86.1% to 94.3% with RSD between 0.79% and 1.91%. Our results suggest that the developed method is
Determination of Astaxanthin in Antarctic Krill Oil by C30 Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography with Solid-Phase Extraction
SUN Lai-di1，LENG Kai-liang2，SUN Wei-hong2，ZHAO Xian-yong3，GAO Hua1，XING Li-hong2，LIU Kun1,*
(EPA、DHA)、虾青素、VA等生物活性成分[1-4]。其中的
更为活跃，生物利用效价更高[9]。因此研究测定南极磷虾
虾青素是目前公认的抗氧化性能最强、安全性好的生物 油中的虾青素具有重要意义。
活性物质[5-6]。Maoka等[7]研究发现，南极磷虾中的虾青素
虾青素属于弱极性化合物，能否将非极性的油脂与
solid-phase extraction (SPE). Following clean up on LC-NH2 solid-phase extraction column, saponification of the extracted compounds was achieved with NaOH-methanol. Subsequent separation was performed on YMC-Carotenoid C30 column with n-hexane-acetone-methanol (1:2:2) as eluent at a flow rate between 2 and 4 mL/min. Injection volume was set at 8
158 2013, Vol.34, No.08
食品科学
※分析检测
需将其中的虾青素酯转化成游离态的虾青素才能定量测 定[10]。油脂若去除不彻底就必然需要提高皂化反应的加 碱量，致使虾青素被不同程度地氧化破坏；同时大量的油 脂也会对色谱柱和仪器带来污损。传统的去油方法大多采 用溶剂萃取而达到预分离目的，但是此方法操作较繁琐、 有机溶剂耗量大且虾青素在处理过程中易损失[11]。固相萃 取技术近年来在样品前处理过程中已得到广泛应用，该 技术能够较好的富集和预分离目标物，适合于批量产品 的高效快速检测[12-13]。本实验在前人的研究基础上，通过 LC-NH2固相萃取小柱对南极磷虾油中的虾青素进行净化 处理，经NaOH-甲醇液皂化处理后，采用C30-反相高效液 相色谱法测定其中的虾青素。
※分析检测
食品科学
2013, Vol.34, No.08 157
固相萃取-C30-RPLC法测定南极 磷虾油中的虾青素
孙来娣1,2，冷凯良2，孙伟红2，赵宪勇3，高 华1，邢丽红2，刘 坤1,*
(1.青岛大学医学院，山东 青岛 266021；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 3.农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室，山东 青岛 266071)
of high reproducibility and recovery and suitable for the analysis of astaxanthin in Antarctic krill oil. Key words：Antarctic krill oil；astaxanthin；solid-phase extraction；C30-reversed phase high performance liquid chromatography
1.2.3 色谱条件[14] 色 谱 柱 ： Y M C - C a r o t e n o i d C 30色 谱 柱
(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；检测器：紫外波 长为474nm；进样量：20μL；流速：1.0mL/min；流动 相：A甲醇，B叔丁基甲基醚，C1%磷酸溶液；梯度洗 脱程序为：0～15min，81%～66% A，15%～30% B， 4% C；15～23min，66%～16% A，30%～80% B，4% C；23～27min，16%～81% A，80%～15% B，4% C； 27～30min，81% A，15% B，4% C。 1.2.4 样品中虾青素3种同分异构体的组成分析
式中：As、Cs分别为全反式虾青素标准工作液的 峰面积和含量；A13-cis、A 、 trans A9-cis、分别为试样溶液中 13-顺虾青素、全反式虾青素、9-顺虾青素的峰面积； 1.3、1.1分别为13-顺虾青素和9-顺虾青素对反式虾青素 的校正因子；m为样品质量；V为试样溶液体积；f为稀 释倍数。
中图分类号：TS254.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630(2013)08-0157-04
南极磷虾油是从南极磷虾中提取得到的深红色黏 以双酯形式存在[8]。双酯型虾青素由于具有更强的亲脂
稠状油脂，含有丰富的磷脂、Omega-3多不饱和脂肪酸 性，其比单酯或游离虾青素更易疏水，在肠道中的吸收
收稿日期：2012-06-11 基金项目：国家“863”计划项目(2011AA090801) 作者简介：孙来娣(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为天然活性物质提取及分析测定。E-mail：sunlaidi1003@163.com *通信作者：刘坤(1962—)，女，教授，研究方向为天然活性物质提取及分析测定。E-mail：kunliu62@yahoo.com.cn
准确称取虾青素标准品10mg，用丙酮溶解并定容于 50mL棕色容量瓶中，得到质量浓度为0.2mg/mL的标准储 备液，充氮密封，置－18℃冰箱中避光保存，有效期1个 月。使用前将储备液用二氯甲烷-甲醇(1:3，含1% BHT) 稀释，配制成适量浓度的标准工作液，所有标准工作液 均需充氮密封，置4℃条件下避光保存，有效期1周。
266071；
摘 要：建立用固相萃取预分离、测定南极磷虾油样品中虾青素3种同分异构体的高效液相色谱法。样品经固相萃 取小柱预分离净化，加NaOH-甲醇溶液皂化反应后，经YMC-Carotenoid C30色谱柱分离得到虾青素3种同分异构体， 采用外标法定量。南极磷虾油中虾青素的最佳净化条件为：以LC-NH2为固相萃取小柱，正己烷-丙酮-甲醇(1:2:2， V/V)为洗脱溶剂，洗脱体积为8mL，洗脱流速控制在2～4mL/min。样品经LC-NH2固相萃取小柱净化后平均添加回 收率为86.1%～94.3%，相对标准偏差为0.79%～1.91%。结果表明，方法重现性好，回收率高，适用于南极磷虾油 中虾青素含量分析。 关键词：南极磷虾油；虾青素；固相萃取；C30-反相高效液相色谱法
同雨生红球藻一样，都是以游离虾青素、虾青素单酯、 弱极性的虾青素有效的分离净化，这对后续虾青素的皂
虾青素双酯3种形式存在；所不同的是雨生红球藻中的虾 化反应及测定显得尤为重要。由于南极磷虾中的虾青素
青素主要以单酯形式存在，而南极磷虾中的虾青素主要 主要以双酯和单酯形式存在，采用C30-HPLC进行测定时
2 结果与分析
2.1 固相萃取条件考察 2.1.1 固相萃取小柱的选择
由于虾青素极易受外界环境的干扰，其在酸性或碱 性条件下都不稳定。为了使样品得到有效的净化，实验 考察了LC-NH2、WAX、WCX、C18、中性氧化铝、硅 胶等固相萃取小柱的净化效果。结果发现硅胶对虾青素 的净化效果不明显且所需洗脱溶剂量大，给目标物的浓 缩带来麻烦；中性氧化铝虽能较好的分离目标物，但实 验的洗脱条件需在酸性环境下进行，致使虾青素结构破 坏；而WAX、WCX主要用于分离酸性或碱性化合物，因 此也不适合虾青素的分离；用C18柱的加标回收率虽然能 达到80%，但油脂也不可避免地洗脱下来；相对于C18柱 而言LC-NH2柱的净化效果更佳，回收率在85%左右。因 此实验最终选择LC-NH2固相萃取小柱净化。 2.1.2 洗脱剂的选择
分析和计算方法：取皂化好的样品进行C30-RPLC分 析，外标法定量。由于13-顺虾青素和9-顺虾青素标准品 价格十分昂贵且难以获得，因此本实验虾青素的定量以 全反式虾青素为参照，其具体计算公式按下式进行[14]：
X = (1.3 × A13-cis + A tra + 1.1× A9-cis ) × Cs ×V × f As × m
样品测定前需先经固相萃取小柱预分离，然后进行 皂化反应得到待测液。固相萃取：准确称取1.0g南极磷 虾油样品于25mL容量瓶中，用正己烷-丙酮(1:4，V/V)溶 解并定容至刻度。准确移取2mL上述待测样品溶解液于 预活化好的小柱中，收集洗脱液于5mL容量瓶中，35℃ 以下氮吹至近干，加入约2mL二氯甲烷-甲醇溶液(1:3， 含1% BHT)，待用。皂化反应：向上述待用样液中准确 加入0.1mol/L的NaOH-甲醇溶液1mL，涡旋混合，充氮 密封，在4℃冰箱中反应12～14h，于皂化反应液中加入 0.4mL 2%的磷酸甲醇溶液中和剩余的碱，用二氯甲烷-甲 醇(1:3，含1% BHT)定容，涡旋混合后过0.45μm微孔滤 膜，供HPLC检测分析。 1.2.2 标准溶液的配制