CRISPRs在德氏乳杆菌中的检测与同源性分析
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１ ． 扩 增 引物 退 火温度确 定 ．２ ２
采用梯度 Ｐ Ｒ的方法对设计 的 Ｃ ＩＰ ｓ Ｃ Ｒ Ｓ Ｒ 引物 的退火温度进行摸索确定 。采用小剂量扩增体 系，
以 Ｋ Ｄ — ＩＣ保 藏 Ｌｃ ｂｃｌ ｅ ｒｅｋｉ １ Ｌ Ｓ ＤＣ ａｔ ａｉｕ ｄｌ ｕｃｉＬ ５为 ｏ ｌｓ ｂ
５ －、５ ．、６ ．和 ６． ７３ ９６ １１ ２０℃等 ８ 梯 度 ，并 根 据 扩 个
网 络 服 务 器 ：Ｃ ＩＰ ａ ｂｓ（ｔ ：ｃｉ ｒ — Ｒ Ｓ Ｒｄｔ ａｅｈｔ ／ｒ ｐ． ａ ｐ／ ｓ Ｕ
ｐｕ ．／ｒｐ／；Ｄ ＡＢａｔｈｔ： ｌｓｎｂ． ｍｎｈ ｏ／ ｓｄ ｒ ｉ ｒ ｆｃ ｓ ） Ｎ ｌ （ｔ ／ ａｔ ｃｉｌ ． ． ｖ ｓ ｐ／ ． ｎ ｉｇ ｂ
东
北 农
业
大
学
学 报
第 ４ 卷 ２
根 生 物 科 技有 限公 司 ） ，大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 Ｊ ０为（ Ｍ１９ 实验 室 自制 ） 。ＭＲ 培 养 基 和 Ｌ Ｓ Ｂ培养 基
等所用 试剂 均为分 析纯 。
１１３ 仪 器 ．－
ｌｇ ． ｉ ； ＲＮＡｆｌ ｅ ｅｖ ｒ ｈｔ：ｒａｔｉ ｎｖｅａ ． ｏ ｏｃ ） ｇ ｏｄ ｗ ｂ ｓｒｅ （ ｔ ／ ｎ ． ． ｉｉ． ｐ ／ ｂｕ ｃ
１０ ３ ， ｈ ａ ００ Ｃ ｉ ） ５ ｎ
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｈ ｔｄ ｅｅ ｔｄ ＣＲＩＰ ｓ ｏ ａ ｔｂ ｃｌｓ ｄ ｌｒｅ ｋｉｎ Ｋ ＤＳ ｎ ｎ ｌ ｅ ｈ ｓ ｒ ｃ ：Ｔ ｉ ｓｕ ｙ ｄ ｔｃｅ ｓ Ｓ Ｒ ｆＬ ｃ ａ ｉ ｅｂｕ ｃ ｉｉ Ｌ 。ａ ｄ ａ ａｙ ｄ ｔｅ ｏ ｌ ｕ ｚ
第 ４ 卷 第 １ 期 ２ １
２ １ 年 １ 月 ０１ １
东
北
农
业
大
学
学
报
４ （１： ９ ２ ２１１１ ￣ ３
ＮＯ ． Ｏ１ Ｖ２ ｌ
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＮｏｔ ａ ｔ ｒ ｕｔｒｌＵｎｖ ｒｉ ｏ ｒ ａ ｒ ｓ ｉ ｌ ａ ｉｅ ｓｔ ｏ ｈｅ Ａｇ ｃ ｕ ｙ
Ｃ ＩＰ ｓ Ｒ Ｓ Ｒ 在德 氏乳杆菌 中的检测与 同源性分析
在 Ｃ ＩＰ ｓ ａ ｂｓ 下载 并根 据标 准菌 株 的 Ｒ Ｓ Ｒ ｔ ａｅ ｄａ
Ｌ ｃｏ ａ ｉ ｕ ｅｂ ｕ ｃ ｉ ｓ ｂ ｐ ｂ ｌ ａ ｉｕ ＣＣ Ｂ ａ ｔ ｂ ｃｌ ｓｄ ｌ ｒ ｅ ｋ ｉ ｕ ｓ ． ｕ ｇ ｒ ｓＡＴ ＡＡ一 ｌ ｃ
１Ｃ ０ 型电泳仪 （ 自 购 北京六一仪器厂 ） Ｖ 凝胶成 ；Ｕ Ｐ 像系统（ 自Ｕ Ｐ 司） Ｈ Ｙ Ｉ Ｂ 购 Ｖ公 ；Ｚ Ｗ —Ｏ 摇床振荡培 Ｏ
Ｄｅｅ ｔ ｎ ａ ｄ ｈ ｔ ｃｉ ｎ ｏｍｏｏ ｙ ａ ａｙ ｉ ｆＣ ａ ｔｂ ｃｌ ｓ ｄ ｌ ｏ ｌｇ ｎ ｌｓｓ ｏ ＲＩ ＰＲｓ ｉ Ｌ ｃｏ ａ ｉｕ ｅ－ Ｓ ｎ ｌ ｂ ｕ ｃ ｉＤ Ｎ ａ ｏ ， Ｕ ｕ ｈｎ ，Ｉ ｕｘ ”（．ｅ ｂｒｏ ａｙ ｃ ｎｅＭｎｔ ｒｅ ｋｉ Ｅ ＧＫｉ Ｈ ＯＧ ｉ ｅｇ Ｌ Ｇ ｏｉ １Ｋｙ ａｏ ｔｙｏＤ ｉ ｉ ｃ， ｉｓｙ ／ ｂ ｃ Ｕ ａ Ｌ ａ ｒ ｆ ｒＳ ｅ ｉｒ
养箱 （ 自上海智 城分析 仪器有 限公 司 ） Ｌ０２ 购 ；Ｐ ２０ 分 析天平 （ 自梅特勒一 购 托利多仪器 （ 上海 ） 限公 司） 有 。
１１ ．． 软 件 ４
３５ Ｃ ＩＰ ｓ 列 ，进 行 待 测菌 株 的 Ｃ ＩＰ ｓ ６ 的 ＲＳ Ｒ 序 Ｒ Ｓ Ｒ 引 物设计 ，设计 软件 采用 Ｐ ｍｅ ｅ ｉｒ 。 ｉ ｐ ｒ ｒ ｒｍｅ ５
ｗｈｃ ｒ ２３ ｂ ｄ ３ ０１ ｐ ｒ ｓ ｅ ｔ ｅｌ．Ｔｈ ｏ ｓ ｎ ｕ ｒ ｃ ｅ ｅ ｔａ 【 ｒｍｕｌｐｅ ａｉｎ ｉｈ ｗｅ ｅ ３ ３ ｐ ａｎ ｂ ｅ ｐ ｃｉ ｙ ５ ｖ ｅ ｃ ｎ ｅ ｓ ｓ ｄｉ ｔｒ ｐ ａ ｆｅ ｅ ｔ ｌ ｌ ｍｅｎｓ ｉ ｇ ｔ ｆ ｒ Ｒｅ ａｉｄ ｏ ｃ ｓｒ ｃｕ ｅ ａ ａ ｅ ｐ ｉｎ ｅｗｅ ｎ ８ １ ｎ ・ ａ ｅ ；ｈ ｒｃ ｅ ｅ ｔ ａ ｈ ｏ ｍａ ｄａ ｐ ｌ ｒ ｍｉ ｔｕ ｔ ｒ ｓｂ ｓ — ａｒ ｇ ｂ ｔ ｅ － ａ ｄ ２１ １ ｂ ｓ ｓ ｔｅ ｄｉ ｔ ｒ ｐ ａ ｓｈ ｄ ｔ ｅ ｎ ｉ ２ ７ ｅ
Ｂａｔ ｇ） Ｄ Ａ ｗ ｂｏｏ（ｔ ：ｗ ｂｏｏ ｅｋｌ ． ｕ ｌｓｃｉ ； Ｎ ｅ ｌ ． ｇ ｈｔ ／ ｅ ｌ ． ｒｅ ｙ ｄ ／ ｐ／ ｇｂ ｅｅ
增亮度和特异性确定引物的退火温度 。反应体系和 反应条件如表 ｌ 所示 。
表 １ 引物梯 度扩增及 Ｃ Ｓ Ｒｓ 列扩增体 系和反应条件 ＲＩＰ 序
分子生物学操作试剂盒（ 自大连宝生物和天 购
基金项 目：教育部长江学者和创新 团队发展计划（ Ｔ ９ ９ Ｉ ０５ ） Ｒ 作者简介 ：邓凯波（ ９ ３ ） １８ 一 ，女 ，博士研究 生，研究方 向为乳酸菌分子生物技术 。Ｅ ｍ ｉ ｋｐ ｅ ｒ ＠ ａｏ． ｏ ．ｎ － ａ ｅｐ ｌ ｅ ｙｈｏ ｃｍ ｃ ｈ ＿ｄ 通讯作者 ： 霍贵成 ，教授 ， 博士生导师 ， 研究方 向为乳品加工与食品微生物。Ｅ ｍ ｉ ｇｈｏ ｖ ．４ １ ｃｍ － ａ ｕ＠ ｉ ０ ５ ．ｏ ｈｃ ｐ
供试菌株与标 准菌株 的重复序列进行多重 比
对 ，并 对 结 果 进 行 Ｄ ＡＳｑ ｅｃ ｇ 作 图 ，预 测 Ｎ ｅｕｎｅｌ ｏ ｏ 序 列 的二级结 构 。
ｓ ｍｅｓ ｅ（ ｐ ａ ｅｔ ｉ ｌｔ ｉ ， ｕ ｔ ｏ ｌ ｙｐ ｓｅｓ ｄｖ ｒ ｂｉ ｍ ａｅ ｉ ｅｇ ｎ ｔ ａ ｉ ２ ｂ ） ｓｔ ｐ ａ ｓ ａ ｓ ｂ ｔｈ ｈ ｍｏ ｇ ｏｓ ｓｅ ａｉ ｉ ｃ ｐ ｒｄｗｔ ｔ ｅ ｅｃ ｚ ９ ｈ ｙ ｃ ｒｎ ｅ ｏ ａｌ ｏ ｙ ｔ ｈｈ ｉ
１ ＿ Ｃ ＩＰ ． ３ Ｒ Ｓ Ｒ序 列扩 增 ２
比对 。
引 物 分 别 对 供 试 菌 株 基 因组 进 行 Ｃ ＩＰ ｓ ＲＳ Ｒ 序
１ ． 重 复序 列 二级 结构预 测 ．６ ２
列扩增 ，反应体系和反应条件如表 １ 所示 。
１ ． Ｃ ＩＰ ． ４ Ｒ Ｓ Ｒ序 列 片段 连接 转化 和鉴 定 ２
ｈ ｏｍｏｏ ｙ ｏ ｈ ｉ ｄｒ ｃ ｅ ｅ ｔ ｎ ｐ ｃ ｅ ｅ ｃ ｓ ｌｇ ｆｔ ｅｒ ｉ ｔｒｐ ａ ｓ ａ ｄ ｓ ａ ｅｒｓ ｑｕ ｎ ｅ ．Ｔｈ ｅ ｕｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔＬ ｎ ９ ｈ ｄ ＣＲＩ ｅ ｅ ｒ ｓ ｌ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ７ ａ ｄ Ｌ ａ ｓ ＳＰＲｓ
１１１ 菌种 ．．
本 研 究 菌 种 Ｌｃ ｂｃｌ ｅ ｒｅｋｉ ７ ９和 ａｔ ａｉｕ ｄｌ ｕｃｉＬ 、Ｌ ｏ ｌ ｓ ｂ
Ｌ５ Ｉ 均为Ｋ Ｄ — ＩＣ Ｌ Ｓ ＤＣ 所藏。
１１２ 试 剂 ．．
中研究 的最 为详尽口 。但是酸奶发酵剂 的另一 ， ”
收稿 日期 ：２ １－ ３ １ ０ １０ — ８
Ｃ ＩＰ ｓＣｕｔ ｅ ｇｌ ｌ ｉ ｅｓａｅ ｏ ｌ － Ｒ Ｓ Ｒ （ ｌｓ ｒｄ ｅｕ ｒ ｔ ｐｃｄ ｈｒｐ ｉ ｅ ｒ ａ ｙｎ ｒ ｓ ｔ ａｎ
种重要乳酸菌一德 氏乳杆菌的研究却比较少。本研 究针对此问题 ，对本实验室筛选并分离的２ 株德氏
乳 杆菌 进行 了 Ｃ ＩＰ ｓ ＲＳ Ｒ 序列 的鉴 定和 同源性 分析 。
析。结果显示，供试 菌株 Ｌ 和Ｌ ７ ９中均含有 Ｃ ＩＰ ｓ Ｒ Ｓ Ｒ 序列 ，分别为３３ ３ｂ 和 ３ １ ｐ ２ ｐ ５ｂ ，多重比对后的重复序列 ８ ０ — １ 位与 ２ ～ ７ ２ １ １ 位碱基 互补形成回文结构 ；重复序列 大小（９ｂ ） ２ ｐ 与标 准菌株基本相 同，但 其同源性与菌株亲缘 关系 具差异性 ，验证 了Ｃ ＩＰ ｓ Ｒ Ｓ Ｒ 结构的水平基 因转移的特点。 关键词 ：Ｃ ＩＰ ｓ Ｒ Ｓ Ｒ ；德氏乳杆 菌；检测 ；同源性 中图分类号 ：￥ ０ ；Ｑ １ ６ １ ８３ 文献标志码 ：Ａ 文章编号 ：１０ — ３９ ２ １ ）１ ０ １ — ５ ０ ５ ９ ６ （０ １ １－ ０ ９ ０
本 地 软 件 ：Ｐｉｅ ｒｍｅ ，Ｄ Ａ Ｎ ．．， ｒ ｒ ｅ ｉｒ ｍ ｐ ５ Ｎ ＭＡ ５２ ２
Ｃｌ ｓａ １８ ｕ ｔｌ Ｘ ． ３， ＭＥＧＡ ４，ＣＬ ｅ ｕ ｎ ｅＶｉｗｅ ５ １ Ｃ Ｓ ｑ ｅ ｃ ｅ ｒ ．。 ６．
模板 ，温度分别设定 为 ：５． ０ 、５ － ４ 、 ０ 、５． ２ 、５． ０ ８ ３ ４
Ｔａ ｌ Ａｍ ｐ ｉ ｃ ｔｏ ｓ ｅ ｓａ ｄ ｒ ａ ｔ ｎ ｃ ｎ ｉｉ ｎ ｆ ｒ ｄ ｅ ｔ ｂｅ１ ｌ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ｍ ｎ ｅ ｃ ｉ ｏ ｄ ｔ ｓ ａ ｉｎ ｉ ｆ ｙ ｏ ｏ ｏ ｇ ＰＣＲ ｎ ａ ｄ ＣＲＩ ＰＲ ｅ ｕ ｎ ｅ Ｓ ｓｑ ｅ ｃｓ
ｒ ｌｔ ｎ ｈｐ ｗｈｃ ａｉａｔｄｔ ｅ ｃ ａ ａ ｔ ｓｏ ＳＰＲｓｈ ｒ ｏｎａ ｅｎ ｒ ｓｅｒ ｅａｉ ｓ ｉ， ｉｈｖ ｌ ｅ ｈ ｒ ｃｅｒ ｆ ｏ ｄ ｈ ＣＲＩ ｏｉ ｔｌ ｚ ｇ ｅｔ ａｎ ｆ ．
Ｋ ｙ ｗ ｏｒ ｓ ＣＲＩＰ ； ａ ｔｂ ｃｌｓｄ ｌｒｅ ｋ； ｅｅ ｔ ｎ ｈ ｍｏｏ ｙ ｅ ｄ ： Ｓ Ｒｓ Ｌ ｃｏ ａ ｉ ｅｂｕ ｃ ｉ ｄ ｔｃｉ ； ｏ ｌｇ ｌ ｕ ｉ ｏ
ｄｏ ｉ ｒ ｅｔ 称为规 律成簇 的间隔短 回文重复 ， ｒ ｃｅ ａ ） ｍ ｐ ｓ 是近年发现的一种具有对外源染色体片段具有获得 性免疫能力的结构 】 。自 １８ 年于 Ｅｃｅｃｉ ｃ ｉ ９７ ｓ ｒｈ ｌ ｈ ｉ ａ ｏ
Ｋ２ １ 中发 现 以来 ，已在 大量 古 细菌 和细 菌基 因组 或 质粒 中发 现 ，分 别约 占９ ％和 ４ ％ 。 ０ ０
ａ／ ｉｂｎＲ Ａ ＿ｄｃｉ。 ｔ ｇ— ｉ Ｎ ｆｌ． ） ｃ ／ ０ ｇ
１ 方法 ． ２
１ ． 乳酸 茵 Ｃ ＩＰ ．１ ２ Ｒ Ｓ Ｒ扩 增 引物 设计
５０ Ｒ５６ 型梯度 Ｐ Ｒ （ 自ＢＯ Ｒ Ｄ公司 ） ８Ｂ ３０ Ｃ仪 购 Ｉ— Ａ ；
９０ Ｃ ｙｔ ７ ０Ｐ Ｒ Ｓｓ ｍ（ 白 Ａ ｐｅ ｉ ｙｔ ｓ ； Ｄ Ｙ ｅ 购 ｐｌ ｄＢｏ ｓ ｍ ） ｉ ｓｅ Ｙ一
邓 凯波 Ｌ ，霍贵成 ，柳 国霞 Ｌ
（． １ 乳品科学教育部重 点实验室 ，哈尔滨 １０ ３ ：２ 东北农业大学食 品学院 ，哈尔滨 ５００ ． １０ ３ ５ ０ ０）
摘
要 ：本研 究检测 了本 实验 室德氏乳杆茵 中的 Ｃ ＩＰ ｓ Ｒ Ｓ Ｒ 结构 ，并对其重复序 列和 间区序列进行 了同源性分
ｏ ｄ ｃ ｔ ｎ Ｈａ ｂ ｎ ０ ３ ，Ｃｈ ｎ ；２ Ｆ ｏ Ｃｏ ｌｇ ， Ｎ ｒ ｅ ｓ ｇ ｉｕｔ ｒ ｌ Ｕ ｉ ｒ ｉ ， Ｈａ ｂｎ ｆ Ｅ ｕ ａｉ ， ｏ ｒｉ ５ ０ ０ １ ｉａ ． ｏｄ ｌ ｅ ｅ ｏｔ ａ ｔＡ ｒ ｌ ａ ｈ ｃ ｕ ｎｖ ｓ ｙ ｅ ｔ ｒｉ
１ 材料与方法
１１ 材料 ．
乳酸菌作为酸奶工业生产 中最重要 的一类细 菌 ，在实际生产中也不断遭受着 噬菌体污染 的侵 害 。已有研究者在一些乳 酸菌 中发现 Ｃ Ｉ Ｒ 结 ＲＳ ｓ Ｐ
构 ，其 中 自 ２０ 年 以来 在 Ｓｒ ｔｃｃｕ ｅｍ ｐ ｉ ０７ ｔｐｏｏｃｓｈｒ ｏｈｌ ｅ ｔ ｓ ｕ
采用梯度 Ｐ Ｒ的方法对设计 的 Ｃ ＩＰ ｓ Ｃ Ｒ Ｓ Ｒ 引物 的退火温度进行摸索确定 。采用小剂量扩增体 系，
以 Ｋ Ｄ — ＩＣ保 藏 Ｌｃ ｂｃｌ ｅ ｒｅｋｉ １ Ｌ Ｓ ＤＣ ａｔ ａｉｕ ｄｌ ｕｃｉＬ ５为 ｏ ｌｓ ｂ
５ －、５ ．、６ ．和 ６． ７３ ９６ １１ ２０℃等 ８ 梯 度 ，并 根 据 扩 个
网 络 服 务 器 ：Ｃ ＩＰ ａ ｂｓ（ｔ ：ｃｉ ｒ — Ｒ Ｓ Ｒｄｔ ａｅｈｔ ／ｒ ｐ． ａ ｐ／ ｓ Ｕ
ｐｕ ．／ｒｐ／；Ｄ ＡＢａｔｈｔ： ｌｓｎｂ． ｍｎｈ ｏ／ ｓｄ ｒ ｉ ｒ ｆｃ ｓ ） Ｎ ｌ （ｔ ／ ａｔ ｃｉｌ ． ． ｖ ｓ ｐ／ ． ｎ ｉｇ ｂ
东
北 农
业
大
学
学 报
第 ４ 卷 ２
根 生 物 科 技有 限公 司 ） ，大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 Ｊ ０为（ Ｍ１９ 实验 室 自制 ） 。ＭＲ 培 养 基 和 Ｌ Ｓ Ｂ培养 基
等所用 试剂 均为分 析纯 。
１１３ 仪 器 ．－
ｌｇ ． ｉ ； ＲＮＡｆｌ ｅ ｅｖ ｒ ｈｔ：ｒａｔｉ ｎｖｅａ ． ｏ ｏｃ ） ｇ ｏｄ ｗ ｂ ｓｒｅ （ ｔ ／ ｎ ． ． ｉｉ． ｐ ／ ｂｕ ｃ
１０ ３ ， ｈ ａ ００ Ｃ ｉ ） ５ ｎ
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｈ ｔｄ ｅｅ ｔｄ ＣＲＩＰ ｓ ｏ ａ ｔｂ ｃｌｓ ｄ ｌｒｅ ｋｉｎ Ｋ ＤＳ ｎ ｎ ｌ ｅ ｈ ｓ ｒ ｃ ：Ｔ ｉ ｓｕ ｙ ｄ ｔｃｅ ｓ Ｓ Ｒ ｆＬ ｃ ａ ｉ ｅｂｕ ｃ ｉｉ Ｌ 。ａ ｄ ａ ａｙ ｄ ｔｅ ｏ ｌ ｕ ｚ
第 ４ 卷 第 １ 期 ２ １
２ １ 年 １ 月 ０１ １
东
北
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大
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４ （１： ９ ２ ２１１１ ￣ ３
ＮＯ ． Ｏ１ Ｖ２ ｌ
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＮｏｔ ａ ｔ ｒ ｕｔｒｌＵｎｖ ｒｉ ｏ ｒ ａ ｒ ｓ ｉ ｌ ａ ｉｅ ｓｔ ｏ ｈｅ Ａｇ ｃ ｕ ｙ
Ｃ ＩＰ ｓ Ｒ Ｓ Ｒ 在德 氏乳杆菌 中的检测与 同源性分析
在 Ｃ ＩＰ ｓ ａ ｂｓ 下载 并根 据标 准菌 株 的 Ｒ Ｓ Ｒ ｔ ａｅ ｄａ
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养箱 （ 自上海智 城分析 仪器有 限公 司 ） Ｌ０２ 购 ；Ｐ ２０ 分 析天平 （ 自梅特勒一 购 托利多仪器 （ 上海 ） 限公 司） 有 。
１１ ．． 软 件 ４
３５ Ｃ ＩＰ ｓ 列 ，进 行 待 测菌 株 的 Ｃ ＩＰ ｓ ６ 的 ＲＳ Ｒ 序 Ｒ Ｓ Ｒ 引 物设计 ，设计 软件 采用 Ｐ ｍｅ ｅ ｉｒ 。 ｉ ｐ ｒ ｒ ｒｍｅ ５
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增亮度和特异性确定引物的退火温度 。反应体系和 反应条件如表 ｌ 所示 。
表 １ 引物梯 度扩增及 Ｃ Ｓ Ｒｓ 列扩增体 系和反应条件 ＲＩＰ 序
分子生物学操作试剂盒（ 自大连宝生物和天 购
基金项 目：教育部长江学者和创新 团队发展计划（ Ｔ ９ ９ Ｉ ０５ ） Ｒ 作者简介 ：邓凯波（ ９ ３ ） １８ 一 ，女 ，博士研究 生，研究方 向为乳酸菌分子生物技术 。Ｅ ｍ ｉ ｋｐ ｅ ｒ ＠ ａｏ． ｏ ．ｎ － ａ ｅｐ ｌ ｅ ｙｈｏ ｃｍ ｃ ｈ ＿ｄ 通讯作者 ： 霍贵成 ，教授 ， 博士生导师 ， 研究方 向为乳品加工与食品微生物。Ｅ ｍ ｉ ｇｈｏ ｖ ．４ １ ｃｍ － ａ ｕ＠ ｉ ０ ５ ．ｏ ｈｃ ｐ
供试菌株与标 准菌株 的重复序列进行多重 比
对 ，并 对 结 果 进 行 Ｄ ＡＳｑ ｅｃ ｇ 作 图 ，预 测 Ｎ ｅｕｎｅｌ ｏ ｏ 序 列 的二级结 构 。
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１ ＿ Ｃ ＩＰ ． ３ Ｒ Ｓ Ｒ序 列扩 增 ２
比对 。
引 物 分 别 对 供 试 菌 株 基 因组 进 行 Ｃ ＩＰ ｓ ＲＳ Ｒ 序
１ ． 重 复序 列 二级 结构预 测 ．６ ２
列扩增 ，反应体系和反应条件如表 １ 所示 。
１ ． Ｃ ＩＰ ． ４ Ｒ Ｓ Ｒ序 列 片段 连接 转化 和鉴 定 ２
ｈ ｏｍｏｏ ｙ ｏ ｈ ｉ ｄｒ ｃ ｅ ｅ ｔ ｎ ｐ ｃ ｅ ｅ ｃ ｓ ｌｇ ｆｔ ｅｒ ｉ ｔｒｐ ａ ｓ ａ ｄ ｓ ａ ｅｒｓ ｑｕ ｎ ｅ ．Ｔｈ ｅ ｕｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔＬ ｎ ９ ｈ ｄ ＣＲＩ ｅ ｅ ｒ ｓ ｌ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ７ ａ ｄ Ｌ ａ ｓ ＳＰＲｓ
１１１ 菌种 ．．
本 研 究 菌 种 Ｌｃ ｂｃｌ ｅ ｒｅｋｉ ７ ９和 ａｔ ａｉｕ ｄｌ ｕｃｉＬ 、Ｌ ｏ ｌ ｓ ｂ
Ｌ５ Ｉ 均为Ｋ Ｄ — ＩＣ Ｌ Ｓ ＤＣ 所藏。
１１２ 试 剂 ．．
中研究 的最 为详尽口 。但是酸奶发酵剂 的另一 ， ”
收稿 日期 ：２ １－ ３ １ ０ １０ — ８
Ｃ ＩＰ ｓＣｕｔ ｅ ｇｌ ｌ ｉ ｅｓａｅ ｏ ｌ － Ｒ Ｓ Ｒ （ ｌｓ ｒｄ ｅｕ ｒ ｔ ｐｃｄ ｈｒｐ ｉ ｅ ｒ ａ ｙｎ ｒ ｓ ｔ ａｎ
种重要乳酸菌一德 氏乳杆菌的研究却比较少。本研 究针对此问题 ，对本实验室筛选并分离的２ 株德氏
乳 杆菌 进行 了 Ｃ ＩＰ ｓ ＲＳ Ｒ 序列 的鉴 定和 同源性 分析 。
析。结果显示，供试 菌株 Ｌ 和Ｌ ７ ９中均含有 Ｃ ＩＰ ｓ Ｒ Ｓ Ｒ 序列 ，分别为３３ ３ｂ 和 ３ １ ｐ ２ ｐ ５ｂ ，多重比对后的重复序列 ８ ０ — １ 位与 ２ ～ ７ ２ １ １ 位碱基 互补形成回文结构 ；重复序列 大小（９ｂ ） ２ ｐ 与标 准菌株基本相 同，但 其同源性与菌株亲缘 关系 具差异性 ，验证 了Ｃ ＩＰ ｓ Ｒ Ｓ Ｒ 结构的水平基 因转移的特点。 关键词 ：Ｃ ＩＰ ｓ Ｒ Ｓ Ｒ ；德氏乳杆 菌；检测 ；同源性 中图分类号 ：￥ ０ ；Ｑ １ ６ １ ８３ 文献标志码 ：Ａ 文章编号 ：１０ — ３９ ２ １ ）１ ０ １ — ５ ０ ５ ９ ６ （０ １ １－ ０ ９ ０
本 地 软 件 ：Ｐｉｅ ｒｍｅ ，Ｄ Ａ Ｎ ．．， ｒ ｒ ｅ ｉｒ ｍ ｐ ５ Ｎ ＭＡ ５２ ２
Ｃｌ ｓａ １８ ｕ ｔｌ Ｘ ． ３， ＭＥＧＡ ４，ＣＬ ｅ ｕ ｎ ｅＶｉｗｅ ５ １ Ｃ Ｓ ｑ ｅ ｃ ｅ ｒ ．。 ６．
模板 ，温度分别设定 为 ：５． ０ 、５ － ４ 、 ０ 、５． ２ 、５． ０ ８ ３ ４
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Ｋ ｙ ｗ ｏｒ ｓ ＣＲＩＰ ； ａ ｔｂ ｃｌｓｄ ｌｒｅ ｋ； ｅｅ ｔ ｎ ｈ ｍｏｏ ｙ ｅ ｄ ： Ｓ Ｒｓ Ｌ ｃｏ ａ ｉ ｅｂｕ ｃ ｉ ｄ ｔｃｉ ； ｏ ｌｇ ｌ ｕ ｉ ｏ
ｄｏ ｉ ｒ ｅｔ 称为规 律成簇 的间隔短 回文重复 ， ｒ ｃｅ ａ ） ｍ ｐ ｓ 是近年发现的一种具有对外源染色体片段具有获得 性免疫能力的结构 】 。自 １８ 年于 Ｅｃｅｃｉ ｃ ｉ ９７ ｓ ｒｈ ｌ ｈ ｉ ａ ｏ
Ｋ２ １ 中发 现 以来 ，已在 大量 古 细菌 和细 菌基 因组 或 质粒 中发 现 ，分 别约 占９ ％和 ４ ％ 。 ０ ０
ａ／ ｉｂｎＲ Ａ ＿ｄｃｉ。 ｔ ｇ— ｉ Ｎ ｆｌ． ） ｃ ／ ０ ｇ
１ 方法 ． ２
１ ． 乳酸 茵 Ｃ ＩＰ ．１ ２ Ｒ Ｓ Ｒ扩 增 引物 设计
５０ Ｒ５６ 型梯度 Ｐ Ｒ （ 自ＢＯ Ｒ Ｄ公司 ） ８Ｂ ３０ Ｃ仪 购 Ｉ— Ａ ；
９０ Ｃ ｙｔ ７ ０Ｐ Ｒ Ｓｓ ｍ（ 白 Ａ ｐｅ ｉ ｙｔ ｓ ； Ｄ Ｙ ｅ 购 ｐｌ ｄＢｏ ｓ ｍ ） ｉ ｓｅ Ｙ一
邓 凯波 Ｌ ，霍贵成 ，柳 国霞 Ｌ
（． １ 乳品科学教育部重 点实验室 ，哈尔滨 １０ ３ ：２ 东北农业大学食 品学院 ，哈尔滨 ５００ ． １０ ３ ５ ０ ０）
摘
要 ：本研 究检测 了本 实验 室德氏乳杆茵 中的 Ｃ ＩＰ ｓ Ｒ Ｓ Ｒ 结构 ，并对其重复序 列和 间区序列进行 了同源性分
ｏ ｄ ｃ ｔ ｎ Ｈａ ｂ ｎ ０ ３ ，Ｃｈ ｎ ；２ Ｆ ｏ Ｃｏ ｌｇ ， Ｎ ｒ ｅ ｓ ｇ ｉｕｔ ｒ ｌ Ｕ ｉ ｒ ｉ ， Ｈａ ｂｎ ｆ Ｅ ｕ ａｉ ， ｏ ｒｉ ５ ０ ０ １ ｉａ ． ｏｄ ｌ ｅ ｅ ｏｔ ａ ｔＡ ｒ ｌ ａ ｈ ｃ ｕ ｎｖ ｓ ｙ ｅ ｔ ｒｉ
１ 材料与方法
１１ 材料 ．
乳酸菌作为酸奶工业生产 中最重要 的一类细 菌 ，在实际生产中也不断遭受着 噬菌体污染 的侵 害 。已有研究者在一些乳 酸菌 中发现 Ｃ Ｉ Ｒ 结 ＲＳ ｓ Ｐ
构 ，其 中 自 ２０ 年 以来 在 Ｓｒ ｔｃｃｕ ｅｍ ｐ ｉ ０７ ｔｐｏｏｃｓｈｒ ｏｈｌ ｅ ｔ ｓ ｕ