流式细胞术操作步骤

流式细胞术的组织样本，你会处理吗？

流式细胞术的组织样本，你会处理吗？前⾔常常听到流式操作的⽼师说，你细胞数量太少⽆法获取有效数据，或者细胞聚团导致管路堵塞等问题。

本来就好不容易排到队去分析样本，还会被后⾯同学各种嫌弃，1min实验有时候10min都没做出来！细胞数⽬的掌握很难，过于稀释浓度不够，过于稠⼜会在通过细胞仪时影响分析，做不出结果，常常是我们做流式的⼀⼤通病。

特别是从组织中分离样本时，这样的问题常常遇到。

本期就看看如何从不同组织中分离出优质样本。

组织样本的单细胞制备与贴壁或者悬浮细胞相⽐，组织样本的单细胞制备相对有⼀定的难度和复杂性，也是同学们最容易出现问题的地⽅，如细胞数量太少，细胞活性不好，细胞碎⽚太多等。

下⾯就具体看看组织中的细胞如何制备。

⽬前，最常⽤两种⽅法是物理法和酶解消化法。

组织样本的处理⽅法⼀、物理⽅法：原理：是指利⽤物理⽅法（机械法）分散组织，经过滤⽹过滤获得单细胞悬液。

应⽤：常⽤于处理部分软组织例如⾻髓、胸腺、脾脏、淋巴结等，或富含细胞的肿瘤组织----淋巴⾁瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及⼀些软组织⾁瘤等，⽤单纯的机械法就可以获得⼤量⾼质量的单分散细胞。

优势：操作⽅便，耗时短，且能获得⼤量的细胞。

缺点：易造成组织细胞机械损伤，如细胞碎⽚和细胞团块，所以常与其他⽅法配合使⽤；对硬组织或纤维组织效果不好。

⼆、酶解消化法：原理：利⽤酶（主要是胶原酶和蛋⽩酶）破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等、⽔解组织细胞的紧密连接结构的蛋⽩质和粘多糖物质以将实体组织分散为单个细胞的⽅法。

应⽤：既可⽤于普通单层的传代细胞也适合致密的组织样本，如上⽪、肝、肾等或含有⼤量结缔组织的肿瘤----⾷管癌、乳腺癌、⽪肤癌等。

优势：适⽤于⼤部分组织样本获取单细胞，酶的种类多选择空间⼤。

缺点：操作步骤⽐较繁琐，消化时间⽐较长且难控制。

不同的组织样本酶种类、浓度、消化时间的选择需要不断摸索优化。

下⾯具体介绍这2种⽅式的操作步骤：⼀物理⽅法1. 吹打：⽤移液枪或注射器反复吹打组织以获得单个细胞的⽅法。

流式细胞术步骤

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡1.细胞按每孔4×105个的密度接种于60 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。

(设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为3组，2μ、5μ、10μ辛伐他汀组正常对照组(组)：胰岛素终浓度0.058A组：辛伐他汀终浓度2μ胰岛素终浓度 0.058；B组：辛伐他汀终浓度5μ胰岛素终浓度0.058；C组：辛伐他汀终浓度10μ胰岛素终浓度0.058；于37℃，52培养箱中孵育48h）2.胰酶消化收集细胞，并用1 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15管中。

3.800 离心5分钟，去除上清，加5 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.5 中。

4.用低速振荡器边震动边加入5 预冷的70%乙醇，固定，4℃过夜。

5.次日将固定好的细胞以1000 的转速离心5分钟，弃上清，加入4 清洗一次，用0.4 重悬细胞。

6.加入5 μL （10 ）37℃消化1小时，加入终浓度50 碘化丙啶（）4℃避光染色过夜（或者37℃避光染色1小时），在流式细胞仪上分析。

利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化1.细胞按每孔4×105个的密度接种于60 细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。

2．胰酶消化收集细胞，并用 1 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15管中。

3 . 800 离心5分钟，去除上清，加5 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.1 中，并转移到1.5 离心管中。

4. 按照1:100加入1一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。

5. 1500，小型离心机离心5分钟，去除上清，加1 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后将洗好的细胞重悬于0.1 中。

6.分别将荧光二抗 488、 567按照1:100比例加入细胞悬液中，室温孵育1小时。

7. 1500离心5分钟，去除上清，加1 缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后重悬细胞于0.2 中。

《流式细胞术贝克曼》课件

贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究中广泛应用，可以用于检测免疫细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液学研究，检测血细胞的表面标志物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤研究，检测肿瘤细胞的表面标志物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的特点，能够在短时间内处理大量细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电检测技术，能够检测到微弱的荧光信号，具有高灵敏度，能够检测到低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多个参数，包括细胞大小、颗粒性、荧光信号等，从而对细胞进行多维度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代

《流式细胞术操作规程》

感谢观看
2、如何提高流式细胞术的检测灵敏度？答：采用较小的样本体积和提高仪器灵敏度可以增加检测的灵敏度。此外，适当增加抗体浓度、延长抗体孵育时间以及使用信号放大技术等也是提高灵敏度的有效方法。
3、如何解决流式细胞术结果的重现性问题？答：为确保流式细胞术结果的可重复性，需要注意以下几点：首先，要使用性能稳定的仪器和试剂；其次，要严格控制实验条件和参数；最后，要对数据进行标准化和规范化处理。此外，对同一份样品进行多次检测也可以提高结果的可靠性。
五、总结
本次演示介绍了南苍术规范化种植标准操作规程，包括种植技术要点、标准操作规程等方面的内容。通过遵循本操作规程，可实现南苍术的规范化种植，提高南苍术的质量和产量，同时降低生产成本和风险。本规程适用于南苍术的种植生产，对于推动中医药产业健康发展具有重要意义。
随着中医药产业的不断发展，南苍术的需求量将进一步增加。为了满足市场需求和提高种植效益，建议加强南苍术规范化种植技术的研究与推广，促进产业升级和可持续发展。应注重品牌建设，提高产品的附加值和市场竞争力，推动南苍术产业的健康发展。
本次演示还强调了实验过程中的安全问题和注意事项，为研究人员提供了一定的参考和指导。总之，流式细胞术的操作规程是进行相关研究的重要基础，遵循规范的操作流程是保证实验结果可靠性的必要条件。
参考内容
流式细胞术是现代医学领域中非常重要的技术之一，它可以在短时间内对大量细胞进行快速、准确的检测和分析。流式细胞术的临床应用范围广泛，涉及到肿瘤、血液病、感染病等多个方面，为临床诊断和治疗提供了重要的帮助。
总之，流式细胞术作为一种强大的工具，在临床应用方面发挥着重要作用。未来随着技术的不断发展，相信流式细胞术将会在医疗领域发挥更加广泛的作用，为人类健康做出更大的贡献。

BD FACSCalibur流式细胞术标准操作规程

BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序目的：规范BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序，正确使用设备，保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。

适用范围：本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。

责任者：操作人员：负责按照本规程操作仪器设备，对仪器进行日常维护，并作使用记录。

保管人员：负责监管仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护、保养。

科室负责人：负责对仪器设备的综合管理。

内容：1. 每日开机程序1.1 在气压阀减压的状态下检查鞘液桶，确认：1.1.1鞘液充满状态，约3L1.1.2盖紧盖子1.1.3安上金属挡板1.1.4管路畅通，无扭曲1.2. 检查废液桶，确认：1.2.1废液桶充满400ml漂白剂1.2.2管路畅通，无扭曲1.3打开流式细胞仪。

1.4打开电脑。

1.5气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。

1.6做Prime。

1.7等待机器预热5~10分钟后可开始试验。

2. 每日关机程序2.1 用3mlFACSClean洗液加入样品管中上样，将样品支撑架置于旁位，以外套管吸入1ml。

2.2 将样品支撑架置于中位，以HI RUN运行10分钟，使内管吸入约1ml。

2.3 将样品管换成蒸馏水重复1-2步。

2.4 放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

2.5 选择Standby模式10分钟，将激光冷却后可关掉主机。

2.6 退出所有应用软件，关闭电脑。

2.7 将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。

3. 每月维护程序3.1 将FACSClean洗液1~2L装入鞘液桶。

3.2 旁路鞘液过滤器（过滤器上的快速接口从SANLINE FILTER端断开，将鞘液白色管路液路取下联到SANLINE FILTER端口），以防伤害。

3.3 将盛有3ml FACSClean洗液的试管置于样品支架上，以HI RUN 30分钟。

3.4 将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤3，以 HI RUN 60分钟。

流式细胞术实验方法

流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。

4、离心，弃上清液。

5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。

7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。

9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。

GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。

以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。

3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。

用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。

4、离心弃上清液。

5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。

6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。

细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。

离心，弃上清。

4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。

细胞生物学技术：7流式细胞术---原理、操作及应用

FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
B 根据抗原表达强弱合理选择抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原：
CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE
C 选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调节补偿。
PMT
前向散射光光电二极管
（二）电信号两种放大方式
• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。
线性(linear; lin)
对数(logarithmic; log)
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。
将信号等比例放大，输出电脉冲信号。
• 模数转换器
将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。
• 数据处理系统
计算机系统数据采集、分析。
（一）光电检测器(photodetector)
• 光电二极管(photodiode) 光灵敏度低，测定强信号（FSC）；
• 光电倍增管(photomultiplier, PMT) 光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。
Time
光信号电信号数字信号
• 通道(channel)
一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：
– 散射光通道: FSC通道和SSC通道； – 荧光通道
• 通道命名方式： – 以FL(fluorescence)加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。 – 以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、 APC通道等。

流式细胞术检测Fluo 4

流式细胞术检测Fluo 4
一、所需材料：PBS，胰酶，Fluo 4，终止消化液（PBS+1%血清）
二、操作步骤
1.6孔板中培养细胞，加药处理24h后，pbs洗3次。

配置2uM Fluo 4稀释液（每1mlPBS加1ul Fluo4），每孔1ml，37℃孵育1h。

2.PBS洗3次，0.8ml胰酶消化1min，吹下来。

0.5ml终止消化液（PBS+1%血清）终止消化（这一步要求总体积不超过1.5ml）。

3.转移至1.5ml EP管，上机检测。

三、备注：
1.终止消化后直接上机：离心麻烦。

胰酶消化后，加入无色的终止消化液，不用离心（离心的目的是去除完全培养液的颜色、血清中的各种蛋白质）。

使用分子生物的离心机3000r，5min，发现细胞贴在壁上，不会沉积在底部。

2.上次对比含/不含酚红的流式检测结果，差别不大。

说明上机的液体是红色的培养液时，不会影响检测结果。

流式细胞操作流程

流式细胞操作流程
流式细胞术是一种用于分析和分类细胞的生物学技术。

以下是典型的流式细胞操作流程：
1.细胞样本准备：
•收集要分析的细胞样本，可以是细胞悬液、组织细胞悬液或血液等。

•对样本进行必要的预处理，如裂解红细胞，去除细胞碎片等。

2.标记细胞：
•使用荧光标记物（荧光染料、抗体等）标记细胞中的特定分子，以便流式仪器能够检测到这些标记。

•标记的目标可以是表面抗原、细胞器、DNA或RNA等。

3.样本染色：
•添加染色剂（荧光标记物）到细胞样本中，使其能够在流式仪器中发光。

•染色通常通过孵育样本和染色剂混合物来实现。

4.细胞固定（可选）：
•如果需要保持细胞在染色后的状态，可以进行细胞固定步骤。

5.样本混合：
•将经过标记和染色的细胞混合均匀，以确保获得代表性的样本。

6.样本注射到流式细胞仪：
•将样本通过流式细胞仪的进样口注入，使其形成单个细胞的流动流。

7.激光激发和信号检测：
•使用激光激发样本中的荧光标记物。

•流式细胞仪会检测细胞产生的荧光信号，并记录下来。

8.数据分析：
•通过计算机软件对收集到的数据进行分析。

•分析可以包括对不同细胞亚群的鉴定、数量统计、染色物的表达水平等。

9.结果呈现：
•将分析结果呈现为图表、图像或表格，以便更好地理解和解释实验结果。

流式细胞术可以用于许多研究领域，如免疫学、细胞生物学、肿瘤学等，以研究和识别不同细胞类型、表达分子的水平等。

流式细胞术操作规程

流式细胞术操作规程流式细胞术是一种常用的细胞分析技术，它可以用来检测和分析细胞表面标记物、细胞数量、细胞分布等信息。

以下是一份流式细胞术操作规程，详细介绍了该技术的操作步骤和注意事项。

一、实验前准备1. 准备所需的实验材料，包括流式细胞仪、标记抗体、孵育培养基、样本组织、显微镜片等。

2. 检查流式细胞仪的功能是否正常，确认仪器能够正常运行。

3. 清洁实验台面，确保操作环境干净整洁。

4. 准备所需的试剂和溶液，如PBS缓冲液、抗体染色溶液等。

二、样本处理1. 准备样本组织，将其转移到离心管中，并添加适量的孵育培养基使其完全浸泡。

2. 使用离心机将样本离心，去除上清液。

3. 重悬样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。

4. 重复洗涤过程，直到样本完全洗净。

三、标记抗体染色1. 取出经过洗涤的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的标记抗体溶液。

2. 在黑暗条件下孵育样本，使其与标记抗体充分结合。

3. 静置反应15-30分钟，确保充分染色。

4. 在光线和温度适宜的条件下冰冻样本，避免抗体的结合。

5. 根据实验需求，可以选择单标记或多标记抗体。

四、样本准备1. 取出经过标记抗体染色的样本，将其转移到离心管中，并加入足够的PBS缓冲液进行洗涤。

2. 将样本离心并去除上清液。

3. 重悬样本，并根据实验需要加入适量的PBS缓冲液进行稀释。

4. 检查样本的细胞数目和活性是否符合实验要求，如有必要，可以使用显微镜进行观察和计数。

五、流式分析1. 打开流式细胞仪，并确认仪器的设置和参数是否符合实验要求。

2. 调整仪器的流速和灵敏度，使其适应样本的特性。

3. 将样本转移至流式细胞仪的样本管中。

4. 开始流式细胞分析，记录并保存实验数据。

5. 根据实验需要，可以进行不同的数据分析和处理，包括细胞分布、细胞数量、表面标记物的表达等。

六、实验后处理1. 关闭仪器，清洁工作台和操作区域。

2. 处理和储存实验数据，可以使用相应的图像科学软件进行数据处理和结果分析。

小鼠脾细胞流式实验步骤_概述说明以及解释

小鼠脾细胞流式实验步骤概述说明以及解释引言部分的内容应包括概述、文章结构和目的。

1. 引言1.1 概述：本文旨在介绍小鼠脾组织中的细胞流式实验步骤。

流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，它能够对单个细胞进行高通量分析，并且在分析多个参数时提供了准确性和高度灵活性。

通过对小鼠脾细胞进行流式实验，我们可以深入了解该组织内不同类型细胞的数量、表型和功能，从而为进一步的研究提供重要依据。

1.2 文章结构：本文分为四个主要部分：引言、小鼠脾细胞流式实验步骤概述、正文和结论。

在引言部分，我们将简要概述本文要讨论的主题，并介绍文章结构；然后，在小鼠脾细胞流式实验步骤概述部分，我们将详细介绍研究对象的相关信息，并解释流式细胞术的基本概念；接下来，在正文部分，我们将重点讨论关于细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法的内容；最后，在结论部分，我们将总结实验结果和发现，并对其意义、局限性以及下一步研究提出展望和建议。

1.3 目的：本文的目的是向读者全面介绍小鼠脾细胞流式实验步骤。

通过详细阐述实验设计、样本制备、细胞处理和标记方法、流式细胞仪操作步骤以及数据分析与统计方法，我们希望读者能够理解并掌握小鼠脾细胞流式实验的基本原理和操作技巧。

同时，通过讨论实验结果与发现的总结、结果意义与局限性的讨论以及对下一步研究的展望和建议，我们希望启发读者思考关于小鼠脾组织中特定类型细胞功能和相互作用机制方面的问题，为相关领域的深入研究提供思路和指导。

2. 小鼠脾细胞流式实验步骤概述：2.1 研究对象介绍：小鼠脾细胞是指从小鼠脾脏中分离出的细胞群体。

小鼠脾脏是淋巴系统的重要器官之一，其中包含各种免疫细胞，如B细胞、T细胞、巨噬细胞等。

小鼠脾细胞流式实验通过对这些免疫细胞进行标记和分析，可以帮助我们了解免疫反应的机制以及疾病发生过程中免疫系统的变化。

2.2 流式细胞术概念解释：流式细胞术（flow cytometry）是一种用于分析和计数单个活动或已死亡的细胞的技术。

微生物量碳氮测定方法

微生物量碳氮测定方法微生物量、碳氮测定方法是研究微生物数量和代谢活性的关键手段，可用于土壤、水体和生物体等环境中的微生物研究。

常用的微生物量、碳氮测定方法包括显微镜计数法、流式细胞术、气体产量法、碳氮比测定法等。

下面将详细介绍这些方法的原理和操作步骤。

一、显微镜计数法显微镜计数法通过显微镜观察和计数微生物的数量来测定微生物量。

其原理是将样品置于显微镜下，在显微镜下观察样品中的微生物数量，并进行计数。

根据计数结果以及标定样品数量的因数，可以推算出样品中微生物的数量。

显微镜计数法的操作步骤如下：1.获取样本并制备薄片。

根据需要采集样本，并将样本制备成薄片或涂片。

可以使用高温固定、化学固定或热固定等方法固定样本。

2.显微镜观察和计数。

将固定的样本放入显微镜下，通过放大镜头观察样本中的微生物，并进行计数。

为了避免重复计数和遗漏计数，可以使用方格计数器。

3.根据计数结果计算微生物量。

根据计数结果以及标定样品数量的因数，可以推算出样品中的微生物数量。

通常计算结果以每克（或每升）样品中的微生物数量表示。

二、流式细胞术流式细胞术是用于计数、分类和分析微生物的一种高通量、高精读的方法。

其原理是将样品中的微生物通过细胞色素或抗原标记，通过流式细胞仪进行激光扫描，扫描到的细胞信号通过计算机进行分析，从而得到微生物的数量、大小和类型等信息。

流式细胞术的操作步骤如下：1.准备样品和染色。

根据需要采集样本，并给样本进行染色。

染色可以使用细胞色素或抗原标记法，将需要测定的微生物区分出来。

2.流式细胞仪扫描。

将染色的样品装入流式细胞仪中，通过激光扫描仪器扫描染色的细胞，并记录扫描到的细胞信号。

3.数据分析。

通过计算机分析扫描到的细胞信号，得到微生物的数量、大小和类型等信息。

三、气体产量法气体产量法是通过测定微生物代谢过程中产生的气体来间接测定微生物的数量和代谢活性。

常用的气体产量法有氧呼吸测定法和甲烷产量测定法。

气体产量法的操作步骤如下：1.准备培养基和反应器。

流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理及注意事项

流式细胞术（flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它通过检测细胞表面和内部分子的存在和数量，从而可以对细胞进行高度特异性的分析和分类。

在临床诊断、生物医学研究以及药物开发等方面都有着重要的应用。

其中，流式细胞术检测淋巴细胞亚群，可以帮助我们更好地了解免疫系统的功能状态，对于免疫相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。

本文将从原理和注意事项两个方面，深入探讨流式细胞术检测淋巴细胞亚群的相关知识。

**一、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理**1. 标本处理流式细胞术检测淋巴细胞亚群的首要步骤是标本处理。

通常情况下，我们会收集外周血进行检测。

在实际操作中，需要抗凝剂进行处理，避免血液凝固，从而保证细胞的完整性。

2. 抗体染色标本处理完成后，接下来是抗体染色。

我们会选择特定的单克隆或多克隆抗体，将其与待检测的淋巴细胞结合。

这些抗体会携带着荧光标记，通过激光的激发，可以将淋巴细胞亚群进行精准识别。

3. 流式细胞分析染色完成后，样本会被注入到流式细胞仪中，通过激光的激发和散射光的检测，可以将不同淋巴细胞亚群进行高效、高速的分析。

在这一步骤中，流式细胞仪会根据荧光信号的强度和特异性来对淋巴细胞进行分类和计数。

4. 数据分析通过计算机对流式细胞仪获取的数据进行分析和解读，我们可以得到淋巴细胞亚群的比例、数量和表达特征等信息，从而更好地了解免疫系统的状态和功能。

**二、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的注意事项**1. 样本保存在进行流式细胞术之前，我们需要认真保存样本，避免细胞的损伤和变性。

通常情况下，标本需要在4摄氏度下保存，并尽快进行检测，避免细胞的失活和降解。

2. 抗体选择在进行抗体染色时，需要根据实际情况选择合适的抗体，保证其对于待检测的淋巴细胞具有高度的特异性和亲和性。

还需要注意避免抗体的交叉反应，以免对结果的准确性造成影响。

3. 仪器校准流式细胞仪作为检测设备，需要定期进行校准和质控。

流式细胞周期结果图解读(仅供参照)

流式检测细胞周期操作步骤1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。

2. 细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。

3. 细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。

4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！流式细胞周期结果图解读1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA 含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。

1、细胞周期可分为四个阶段：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。

单个核细胞分离及流式细胞术检测方法

单个核细胞分离及流式细胞术检测方法
1.取外周血20mL，转移至250mL无菌生理盐水瓶中，加20mL生理盐水混匀，按照体积比3：1加入羟乙基淀粉，即加入13.5mL羟乙基淀粉，充分摇匀后，室温静置15min。

此时加上操作，一共需要耗时25min。

2.吸取上层清亮溶液至50mL无菌离心管，20℃，1800rpm，离心5min，弃上清，最后用10mL生理盐水重悬细胞。

此时加上操作，共耗时25min。

3.吸取提前预热至室温的Ficou人淋巴细胞分离液10mL于50mL离心管中，将细胞悬液沿管壁缓慢加入到分离液中，室温，2000rpm离心25min。

此时加上操作，共耗时35min。

4.小心吸取中间白膜层置于另一无菌15mL离心管，加生理盐水补足体积至
13mL，吹打混匀，室温，1800rpm离心5min，弃上清液，然后再重复该步骤1次。

此时加上操作，共耗时20min。

5.用500微升生理盐水重悬，稀释100倍进行细胞计数，吸取合适数量的细胞进行流式标记（共分为23个流式标记管，至少需1.15×107细胞），每管50微升孵育体积，每种抗体加入1.5微升，全部加完后用中枪混匀，放于4度冰箱孵育30min，并每10min弹匀一次。

此时加上操作，共耗时80min。

6.取出孵育完毕的抗体，用PBS清洗两次（2000rpm离心5min），最后用200微升PBS重悬。

此时加上操作，共耗时40min。

7.将样品拿至流式检测室过筛网，上机检测。

此时加上操作，共耗时45min。

8.关机及出流式报告，30min。

流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项

流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。

2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。

4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

(四)注意事项1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

附:1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaNO３终浓度0.2％)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaNO３0.2g (终浓度0.02％)流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。

流式细胞术操作步骤

流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。

流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项

流式细胞仪标本制备的操作步骤与注意事项(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。

2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。

4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

(四)注意事项1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

附:1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaNO３50ml (终浓度0.2％)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaNO３0.2g (终浓度0.02％)流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。