昆虫细胞的培养综述

昆虫细胞培养及其应用进展

摘要: 随着生命科学的迅速发展, 细胞工程愈来愈受到人们的重视。以昆虫细胞为对象的细胞培养技术在现代实验生物学上具有重要的价值, 已经广泛地应用于医学、农业及生物学的各个领域。本文综述了有关昆虫细胞培养的研究进展, 包括昆虫细胞培养基研究开发, 昆虫细胞系的建立和组织培养, 利用生物反应器大规模培养昆虫细胞, 昆虫细胞2杆状病毒表达系统,构建基因工程细胞系及其稳定性表达, 以及昆虫细胞培养的应用前景和研究展望。

关键词: 昆虫细胞系; 昆虫细胞培养; 基因表达;培养条件昆虫的组织培养最早始于1915 年, 直到1962 年Grace 才成功建立了世界上第一个细胞系, 此后昆虫细胞培养在世界范围内广泛开展, 不断有新细胞系建立的报道。现在, 昆虫细胞培养已在细胞生物学、分子生物学、昆虫学、病毒学、生物化学、遗传学等领域的研究工作中发挥着重要的作用。

1昆虫细胞培养基

昆虫细胞培养基的发展经历了天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段. 天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液. 合成培养基最大的特点是各种成分已知.无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上, 在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子, 能够保证细胞生长良好无须补加血清的培养基. 昆虫细胞培养基的发展主要是合成培养基的发展.[1] 体外培养昆虫组织的首创者是R ichard Ben2dict (1915), 但他当

时没有合适的昆虫细胞培养基。T rager 首次研究了培养基中昆虫细胞的生长条件, 目的是证明单个细胞能在体外存活几天, 并利用昆虫细胞培养基研究昆虫和哺乳动物病毒。1956 年, Silver W yatt 改进了用于家蚕(B om byx m ori L innaeus) 蛹的培养基, 成功地使细胞存活了14d。他的培养基含有浓度与家蚕血淋巴成分相应的21 种氨基酸、5 种盐、3 种有机酸、以及果糖、海藻糖和葡萄糖, 并相应调解了pH 值和渗透压, 这为昆虫细胞培养基的研究奠定了重要的基础。1956 年就在W yatt 发表论文时, Grace 在W yatt 的培养液中增加了胆固醇、内分泌腺和卵巢组织的提取物以及含有10 种B 族维生素的混合物, 使4 龄家蚕幼虫的卵巢细胞存活了29d。从此, 昆虫细胞培养基的研究便迅速发展起来。到目前为止, 至少已报道了60 多种昆虫细胞培养基。许多昆虫培养基配方正不断得到改进, 以使之适于细胞生长。最通用的商品培养基Grace氏培养基、TC2100、IPL 241、TNM 2FH 以及经改良的哺乳动物细胞培养基TC1992M K 等。TC2100 适合于苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒在草地贪夜蛾细胞系(Sf9 细胞系) 中生长, 但它仅适用于实验室而不适用于大规模培养, IPL 241 提高了昆虫细胞系的生产规模, 利于杆状病毒的有效生产。这些培养基是呈液体或粉剂的商品, 使用时通常补充5%～10% FBS(牛血清) 和一些蛋白水解物或抽取等复杂添加剂。牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基, 含有丰富的细胞生长所必要的营养成分即提供生长因子、脂类、蛋白及无机盐。细胞培养的关键是培养基配方的开发, 已有多种培养基用于支持昆虫细胞系的生长。昆虫细

胞培养所用培养基一般均补加FBS, 血清提供了细胞生长过程中所需的营养物质和微量元素, 使细胞能健康生长和传代。但是FBS 的使用也存在着缺点: ①价格高; ②每批血清的质量不同, 影响细胞的生长和病毒复制; ③血清中的蛋白影响从培养的上清液中分离和提取重组蛋白, 使蛋白的纯化更加困难;④血清易被支原体污染。由于部分加入胎牛血清或牛血清使典型昆培养基变得很复杂。因此, 无论工业上或学术上, 开发无血清培养基都是必然的趋势。昆虫细胞无血清培养基的研究始于20 世纪60 年代末和70 年代初, 发展无血清培养基, 必须寻找适当的具有类似于血清功能的因子, 由于血清成分复杂, 具有多种促细胞生长和增殖因子, 因此要找到血清的替代物是相当困难的。目前, 通常的添加物有酵母自溶物、蛋白胨、胰蛋白胨、蛋黄乳液、酵母抽提物水解乳蛋白及微量元素等。近年来已先后研制出多种无血清或低蛋白培养基如SFM 25、CDM、Sf2900˚、Excell400、ISFM 等, 但缺点是适用范围小。CDC 培养基的出现, 打破了无血清培养基的局限, 它既可用于双翅目细胞培养, 又可以用于鳞翅目细胞系的培养, 而且不需要预先的适应步骤。由于在无血清培养基中含有从血清或动物脏器中纯化的蛋白成分, 如胰岛素、转铁蛋白、白蛋白和脂蛋白等, 增加了分离纯化的难度和成本。细胞在无血清低蛋白或无蛋白培养基环境中对剪切应力更为敏感, 故需适当提高保护剂的浓度如FluronicRF68 到0. 3%。无血清培养基的应用有时会降低重组蛋白的产量, 在无血清培养基内, 较高的细胞生长密度与相对较低水平的重组蛋白产量这一事实表明, 促进细胞分裂的因子与促进重

组蛋白生产的杆状病毒感染晚期起作用的因子是不尽相同的。无血清培养基配方还需进一步改进以便适应于重组蛋白的表达。[2]

2昆虫细胞系的建立

昆虫细胞培养的奠基人是德国的R ichardBendict(187821958), 他在1915 年发表了有关昆虫细胞培养的第一篇论文。1956 年W aytt 在分析蚕淋巴化学成分的基础上, 模拟昆虫的血淋巴, 设计出最早的昆虫组织培养液。Grace 对W yatt 的培养基配方作了一些改进, 并首先建立了 4 个桉蚕蛾卵巢细胞系(1962)。虽然已建立了很多的昆虫细胞系, 但迄今为止, 研究和应用得最多的是草地贪叶蛾(Spodop tera f rug iperda)卵巢细胞系Sf21 及其克隆株Sf9 和粉纹夜蛾(T richop lusiani) 胚胎细胞系BT I2Tn52B124 (商业上称之为H igh Five)。昆虫细胞进行原代培养时, 为了克服微生物污染的问题, 可以对室内养虫进行体表消毒和在培养基中加入抗生素, 但传代培养时培养基中加入抗生素对细胞生长不利。最初培养的昆虫细胞主要以血细胞、成纤维细胞为主。而现在已建立的细胞系则主要来源于未发育成熟组织, 如胚胎、器官芽和卵巢。用未成熟或未分化的组织建立细胞系比用成熟组织容易, 主要是因为其中干细胞含量高。未成熟组织的细胞系建立早于成熟组织细胞系, 1962年Grace初次建立了4个桉蚕卵巢细胞系,在此之后又相继建立了多种未成熟组织的昆虫细胞系。1985年M itsuhashi等成功地建立了昆虫血球细胞系, 而对神经细胞、肌肉细胞、体壁细胞、马氏管、唾腺、脂肪体细胞进行离体培养仅存活一段时间。已有许多研究者尝试用成熟组织建立昆虫细胞系,