多肽固相合成研究进展_ (1)

·研究报告·

生物技术通报

BIOTECHNOLOGY BULLETIN

2012年第1期

收稿日期: 2011-06-16基金项目: 贵州省教育厅自然科学研究项目重点项目[黔科教（2009）0132号],贵州省优秀科技教育人才省长专项资金项目[黔省专合字

（2009）104号] ,农业科技成果转化资金项目（2009GB2F200330）,科技人员服务企业行动项目（2009GJF20047),贵州省科技厅农业攻关项目（黔科合NY 字［2011］3052号）

作者简介:陈卓,男,博士,副教授,研究方向:植物分子生物学; E -mail: gychenzhuo@

NPR1多肽抗体的制备和应用

陈卓 刘家驹 毕亮 李向阳 胡德禹 于丹丹 王贞超 杨松 宋宝安

（贵州大学绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地, 贵阳 550025; 贵州大学绿色农药与农业生物

工程教育部重点实验室, 贵阳 550025）

摘 要： 根据NCBI GenBank 中报道的NPR1一级结构信息，采用Blastn 、Blastx 、ExPASy 和Protean 等软件进行序列同源性和抗原性指数分析，获得三段序列特异性较高的多肽，并从中优选一段序列特异性多肽，采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得序列特异性最好的多肽，采用HPLC 和LC -MS 测定合成多肽的浓度和分子量，试验表明目的多肽纯度达88%、目的多肽分子量为1.92234 kD 。采用碳化二亚胺法将多肽与KLH 进行偶联获得免疫原Pep -KLH ，并将其免疫新西兰大白兔以获得抗血清和多克隆抗体，采用ELISA 和Western blotting 测定其效价和特异性，经ELISA 检测表明抗血清和多克隆抗体可与Pep 发生特异性免疫反应，经Western blotting 试验表明抗血清和多克隆抗体可识别烟草叶片特异性条带，其相对分子量为65 kD ，与预测分子量相符，表明利

用该方法制备的NPR1多肽抗体具有较高特异性和灵敏度。

关键词： 非表达型病程相关蛋白 序列分析 多肽 合成 多克隆抗体

Preparation and Application of Polyclonal Antibody

with a Peptide of NPR1

Chen Zhuo Liu Jiaju Bi Liang Li Xiangyang Hu Deyu Yu Dandan Wang Zhenchao Yang Song Song Baoan

（State Key Laboratory Breeding Base of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering , Guiyang 550025; Key Laboratory of Green Pesticide

and Agricultural Bioengineering, Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025）

Abstract: According to the primary structure of information about NPR1 in NCBI GenBank, 3 polypeptides with sequence -specific were obtained using Blastn and Blastx software. One polypeptide was synthetized by fmoc solid phase synthesis methods, and determined theirs purity and molecular weight using HPLC and LC -MS with purity value reaching at 88% and molecular weight being at 1.92234 kD. The polypeptide was coupled to keyhole limpet hemocyanin （KLH） to form a complex of Pep -KLH by EDC. Anti -sera were acquired by immunizing rabbit with Pep -KLH emulsified by complete freund’s adjuvant （CFA） and incomplete freund’s adjuvant （IFA）, and polyclonal antibody was purified by affinity chromatography. The titer and specificity of anti -sera and polyclonal antibody were determined by ELISA and Western blotting. The results showed that anti -sera and polyclonal antibody reacted with Pep -KLH and detected a specific band of 65 kD, and the size was agreed with the predicted molecular mass. The NPR1 polyclonal antibody revealed high sensitivity and specificity.

Key words: Nonexpressor of pathogenesis -related genes 1 （NPR1） Sequence analysis Polypeptide synthesizing Polyclonal antibody

系统性获得性抗性（systemic acquired resistance, SAR）在植物体内具有持效长、作用谱广的抗病特性，在植物体内，它常被外来入侵的病原生物所激发［1,2］。植物SAR 常被植物体内的内源性激素——

水杨酸（salicylic acid, SA）所调控［3-6］，同时引起病程相关蛋白的表达上调并发挥广泛的抗真菌、抗细菌和抗病毒的活性［7-9］。NPR1（nonexpressor of pathogenesis -related genes 1），又称为NIM1或SAI1，