酶联免疫吸附实验精选课件

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免疫标记技术 = 免疫技术 + 标记技术
抗原抗体反应 特异性
酶
示踪物标记 荧光素
同位素
灵敏性
免疫标记技术的主要特点： 高度特异性、高度灵敏性
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免疫标记技术
放射物标记技术
酶标记技术
免疫荧光技术
其他标记技术
酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术
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酶免疫技术(enzyme immunoassay)
(一)测定抗原的，主要有四种方法 1.竞争法 2.双抗体夹心法 3.改良的双抗体夹心法 4.抑制性测定法。
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(二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法， 也 是目前最常用的方法.
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三、实验步骤
乙肝病毒存在三对抗原抗体系统 1.即表面抗原（HbsAg）和表面抗体（抗-HBs）、 2.e抗原（HBeAg）和e抗体（抗-HBe）、 3.核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗-HBc）
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微孔条已经包被HBsAb
1、编号：微孔条按顺序编号。 2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul， 空白对照。 3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加， 轻拍混匀。 4、温育：贴上胶纸，37℃温育30分钟。 5、洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持 30-60秒的浸泡时间）。 6、显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，封口，37℃暗置 10-15分钟。 7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。 8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果， 读数在加终止液10分钟内完成。
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免疫标记技术（immunolabelling technique）
是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或 电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行 的抗原抗体反应。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位 分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、 免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。
最适吸收波长为 450nm。
2.碱性磷酸酶(AP)
常用底物 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。
AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性较HRP差，且价
高，故应用不如HRP普及。 精选ppt
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Colorimetric ELISA Substrates
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ELISA常用的几种方法
是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应 相结合而建立的一种免疫检测技术。
就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原 或抗体的一种免疫学标记技术。
Ag + AbE
AgAbE
+ 底物
呈色反应
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酶联免疫吸附试验ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）
由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果， 从而使测定方法达到很高的敏感度。
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常用酶及其底物
peroxidase (POD)
1.辣根过氧化物酶(HRP)
常用底物：
(1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。
(2)四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌
性, 但水溶性差。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，
本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环 抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。
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ELISA的基本原理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，是 蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保 持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物， 而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
是一类常用的酶免疫技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固 相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。
ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种 病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面 的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量 测定。
ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操 作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之 内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行 病学调查。
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底 物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜 色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比 例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
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ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程 称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗 原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物 反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗 体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可 包被抗体，测定抗原含量。
酶联免疫吸附实验
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一、实验目的
• 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理 • 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法 • 了解其他免疫标记技术
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二、实验原理
免疫学分析方法发展很快，特别是在使用 标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来 许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都 不能相比。继50年代的免疫荧光（IF）和60年 代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代 初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技 术（酶免疫技术）。
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结果判定：
1、临界值（CO，cutoff）的计算：临界值=阴性对照 孔OD均值N×2.1。
2、阴性对照孔OD (optical density)均值大于0.1时重 新实验，小于0.05时以0.05计算。 结果判定：样品OD值S/ CO≥1者为阳性， 样品OD值S/ CO＜1者为阴性。
因核心抗原主要存在于肝细胞中，血清中不能表达，检测困难， 故只能检测二对半而不能检测三对，所以称为二对半。
HBV感染后的血清学指标:
HBsAg, HBsAb
乙肝表面抗原，存在ຫໍສະໝຸດ BaiduHBV感
HBeAg, HBeAb
染者的血清中,为感染指标之
一。
HBcAb(IgG,IgM) 精选ppt
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实验材料
1.HBsAg诊断试剂盒 2.HBsAg抗原（阳性对照），阴性血清，待 检血清