医学科研论文与写作：分子医学实验方法
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分子医学实验方法
如何在体外表达一个基因？ 如何检测一个基因的表达？
如何在体外表达一个基因？
如何在体外表达一个基因
基因的获取 基因的克隆——重组DNA技术 基因的表达 表达产物的鉴定 表达产物的纯化
一、基因的获取
1. 化学合成法 2. PCR法：基 从公司购买
C
18 UCU Ser S 18 UCC Ser S 1 UCA Ser S 1 UCG Ser S 3 CCU Pro P 0 CCC Pro P 4 CCA Pro P 36 CCG Pro P 36 ACU Thr T 26 ACC Thr T 3 ACA Thr T 0 ACG Thr T 93 GCU Ala A 10 GCC Ala A 45 GCA Ala A 28 GCG Ala A
基因重组技术需要：
一个载体： 质粒、噬菌体、病毒、cosmid、BAC和YAC等
两种酶： 限制性内切酶 连接酶
质粒是最常用的载体
复制起点ori 筛选基因 多克隆位点（Multiple
cloning site ，MCS）
ori
限制性内切酶——“分子剪刀”
限制性内切酶和连接酶共同作用可将不同的 DNA分子连接形成重组DNA分子
测序引物 定点突变 核酸杂交探针
2. PCR
9
PCR扩增目的基因
引物
5’
5’
3’ 5’
引物
基因组
引物设计原则：
（1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制
引物设计软件：
Primer Premier、Oligo Primer 3、Primer-BLAST
TaqDNA聚合酶
模板DNA dNTP 引物 Buffer
预变性
94oC5’
模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程
循 94℃ 环 55 ℃ 仪 72 ℃
R产物
加样孔
DNA Marker
2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法
择
)
α
互 补
利用α互补原理筛选重组体pUC18
重组DNA技术
三、基因的表达
1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常 用)
➢ 优点：简单、经济、产量高
➢不足：
不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体； 很难表达大量可溶性蛋白。
筛选标记
强启动子 表达元件： 终止子
SD序列
启动子
转录单位
MCS
终止子
表达载体
ori •表达载体除了具备克隆 载体的特性外，还应具备 必要的表达调控元件，如 完整转录单位。
Prokaryotic promoter
start point
PT7
SD MCS
Terminator
1、表达元件：
(1)启动子
获取基因的序列和名称
在获取基因之前如果能知道基因的序列将使 这一过程变得非常方便。
人类基因组数据库提供了所有已知基因的序 列。
地址为/
1. 化学合成法
通常用于合成较短的基因（<100 base），也可用于合成较长的基因 （kb） 用途：PCR引物
1 UUA Leu L 2 UUG Leu L 4 CUU Leu L C 3 CUC Leu L 0 CUA Leu L 79 CUG Leu L 13 AUU Ile I A 51 AUC Ile I 0 AUA Ile I 30 AUG Met M 54 GUU Val V G 6 GUC Val V 40 GUA Val V 16 GUG Val V
切
接
以
质
粒
为
转
载
体
的
DNA
克
隆
筛
过
程
转
• 质粒转入细菌——转化 (transformation) • 质粒转入真核细胞——转染 (transfection) • 病毒转入细胞——感染 (infection)
筛：重组体的筛选
1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
(2)终止子 (3)SD顺序
Ampicillin resistance
Prokaryotic Expression Plasmid
Lac I
ori
原核表达质粒pET-28a
尽量选择E.coli偏爱的密码子
E.Coli 核糖体蛋白质的密码子使用频率
U
10 UUU Phe F U 23 UUC Phe F
人体基因克隆
Restriction enzyme EcoRI
–Bacterial enzyme that stops viral reproduction by cleaving viral DNA –Act as molecular scisssors (cut plasmids and foreign human DNA) –Produce short single stranded “sticky ends” where insertions of foreign DNA can be made 21
琼脂糖凝胶电泳图谱
基因组PCR
以基因组DNA为模板，得到的 PCR产物是含有内含子的基因
逆转录酶PCR（RT-PCR）
RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合 成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增 （达ng～ug水平）
比基因组DNA少了内含子 cDNART-PCR•/Courses/genomics/RTPC酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组二、基因的克隆——重 组DNA技术
重组DNA技术作为分子医学中最重要、最 基本的技术之一，是许多分子医学实验实 施的基础，在基因诊断、治疗和预防中具 有举足轻重的意义。
1) 大肠杆菌(E.coli)
大肠杆菌的特点
1）革兰氏染色阴性。 2）在细胞膜外侧有细胞壁，由肽聚糖构成. 3）生长一代需要20-30分钟。
20-30min 12 hours
6-8 Billion bacteria
2) 原核表达载体：
在原核细胞中表达 外源基因的载体。
插入位点 克隆元件： 复制原点
如何在体外表达一个基因？ 如何检测一个基因的表达？
如何在体外表达一个基因？
如何在体外表达一个基因
基因的获取 基因的克隆——重组DNA技术 基因的表达 表达产物的鉴定 表达产物的纯化
一、基因的获取
1. 化学合成法 2. PCR法：基 从公司购买
C
18 UCU Ser S 18 UCC Ser S 1 UCA Ser S 1 UCG Ser S 3 CCU Pro P 0 CCC Pro P 4 CCA Pro P 36 CCG Pro P 36 ACU Thr T 26 ACC Thr T 3 ACA Thr T 0 ACG Thr T 93 GCU Ala A 10 GCC Ala A 45 GCA Ala A 28 GCG Ala A
基因重组技术需要：
一个载体： 质粒、噬菌体、病毒、cosmid、BAC和YAC等
两种酶： 限制性内切酶 连接酶
质粒是最常用的载体
复制起点ori 筛选基因 多克隆位点（Multiple
cloning site ，MCS）
ori
限制性内切酶——“分子剪刀”
限制性内切酶和连接酶共同作用可将不同的 DNA分子连接形成重组DNA分子
测序引物 定点突变 核酸杂交探针
2. PCR
9
PCR扩增目的基因
引物
5’
5’
3’ 5’
引物
基因组
引物设计原则：
（1) 序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制
引物设计软件：
Primer Premier、Oligo Primer 3、Primer-BLAST
TaqDNA聚合酶
模板DNA dNTP 引物 Buffer
预变性
94oC5’
模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程
循 94℃ 环 55 ℃ 仪 72 ℃
R产物
加样孔
DNA Marker
2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法
择
)
α
互 补
利用α互补原理筛选重组体pUC18
重组DNA技术
三、基因的表达
1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常 用)
➢ 优点：简单、经济、产量高
➢不足：
不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体； 很难表达大量可溶性蛋白。
筛选标记
强启动子 表达元件： 终止子
SD序列
启动子
转录单位
MCS
终止子
表达载体
ori •表达载体除了具备克隆 载体的特性外，还应具备 必要的表达调控元件，如 完整转录单位。
Prokaryotic promoter
start point
PT7
SD MCS
Terminator
1、表达元件：
(1)启动子
获取基因的序列和名称
在获取基因之前如果能知道基因的序列将使 这一过程变得非常方便。
人类基因组数据库提供了所有已知基因的序 列。
地址为/
1. 化学合成法
通常用于合成较短的基因（<100 base），也可用于合成较长的基因 （kb） 用途：PCR引物
1 UUA Leu L 2 UUG Leu L 4 CUU Leu L C 3 CUC Leu L 0 CUA Leu L 79 CUG Leu L 13 AUU Ile I A 51 AUC Ile I 0 AUA Ile I 30 AUG Met M 54 GUU Val V G 6 GUC Val V 40 GUA Val V 16 GUG Val V
切
接
以
质
粒
为
转
载
体
的
DNA
克
隆
筛
过
程
转
• 质粒转入细菌——转化 (transformation) • 质粒转入真核细胞——转染 (transfection) • 病毒转入细胞——感染 (infection)
筛：重组体的筛选
1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
(2)终止子 (3)SD顺序
Ampicillin resistance
Prokaryotic Expression Plasmid
Lac I
ori
原核表达质粒pET-28a
尽量选择E.coli偏爱的密码子
E.Coli 核糖体蛋白质的密码子使用频率
U
10 UUU Phe F U 23 UUC Phe F
人体基因克隆
Restriction enzyme EcoRI
–Bacterial enzyme that stops viral reproduction by cleaving viral DNA –Act as molecular scisssors (cut plasmids and foreign human DNA) –Produce short single stranded “sticky ends” where insertions of foreign DNA can be made 21
琼脂糖凝胶电泳图谱
基因组PCR
以基因组DNA为模板，得到的 PCR产物是含有内含子的基因
逆转录酶PCR（RT-PCR）
RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合 成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增 （达ng～ug水平）
比基因组DNA少了内含子 cDNART-PCR•/Courses/genomics/RTPC酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组二、基因的克隆——重 组DNA技术
重组DNA技术作为分子医学中最重要、最 基本的技术之一，是许多分子医学实验实 施的基础，在基因诊断、治疗和预防中具 有举足轻重的意义。
1) 大肠杆菌(E.coli)
大肠杆菌的特点
1）革兰氏染色阴性。 2）在细胞膜外侧有细胞壁，由肽聚糖构成. 3）生长一代需要20-30分钟。
20-30min 12 hours
6-8 Billion bacteria
2) 原核表达载体：
在原核细胞中表达 外源基因的载体。
插入位点 克隆元件： 复制原点