项目4特殊染色法
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【附录】
1．抗酸染色液的制备
称取碱性复红10g研磨，95%酒精溶解后终体积为100ml，制成复红酒精饱和液，再取此饱和液10ml与5%石炭酸水溶液90ml混合，用滤纸过滤即可使用（此染液与革兰氏染液所用的石炭酸复红液不同之处是不需10倍稀释）。
2．碱性美兰染液
首先取美兰5~7g和100ml酒精制成美兰酒精饱和液，再取美兰饱和液30ml，与0.1%氢氧化钾水溶液100ml混合，用滤纸过滤即成（此溶液越陈旧，染色效果越好）。
③去掉滤纸片，待玻片冷却后，水洗。
④用3%盐酸酒精脱色，直到流下的液体无色为止，进行水洗。
⑤用碱性美兰染液复染30s，水洗，干燥，镜检。
【结果观察】
结核杆菌染成红色，细长、直的或微弯曲杆菌，偶尔有杆菌着色不均，呈颗粒状者。标本的其余部分及非抗酸性细菌染成兰色。必须逐一观察各个视野，直到全部涂片找不到结核杆菌时，才可报告阴性。
【附录】
户田氏染色液的制法：
甲液明矾饱和水溶液2份
5％石碳酸水溶液5份9份
20％鞣酸水2份临用前混合，过滤。
乙液碱性复红酒精饱和液1份
四、芽胞染色法
芽胞(Spore)是细菌的休眠状态，对各种理化因素有强大的抵抗力，能耐受恶劣环境的影响。芽胞折光性很强，可经特殊染色法染色后，在光学显微镜下观察。本实验要求学生了解两种特殊染色法并认识这种细菌特殊构造。
抗酸性细菌如结核杆菌等分枝杆菌属细菌，细菌细胞壁有很多脂类物质，石碳酸复红加温染色后，其中的分枝菌酸与石碳酸复红结合成牢固的复合物，能够抵抗盐酸酒精的脱色，使菌体保留红色，故称抗酸染色法。
其他非抗酸菌和组织细胞因不能抵抗盐酸酒精的脱色，被脱成无色，后经碱性美兰染色后染成兰。
【材料】
1．结核病人的喀痰或卡介苗
三、鞭毛染色法
【原理】
鞭毛(Flagella)是细菌的运动器官。细菌的鞭毛很纤细，直径仅20nm，不能用普通显微镜观察，不易被普通染色法染色，只有经特殊染色处理，增加鞭毛直径，才能在光学显微镜下观察。本实验要求学生了解这种特殊染色法并认识这种细菌特殊构造。
【材料】
①伤寒杆菌斜面纯培养物(注：系首先将细菌在肉汤中多次传代，然后移种于加少量蒸馏水的琼脂斜面培养基上，37℃培养7~16h)。
【材料】
①破伤风杆菌24h琼脂斜面纯培养物
②3％孔雀绿水溶液
③0.5％花红水溶液
④载物玻片
【方法】
1．取破伤风杆菌培养物涂膜、干燥、火焰固定。
2．滴加3％孔雀绿水溶液加热染色3～6min，水洗。
3．0.5％花红水溶液复染0.5～1min，水洗，干燥，镜检。
【结果观察】
芽胞染成绿色，菌体染成红色。
注意芽胞的形状、在菌体中的位置和大小(与菌体横径比较)。同时可能看到没有芽胞的繁殖体和失掉菌体的芽胞。
二、荚膜染色法
细菌的荚膜(Capsule)具有保护细菌抵抗吞噬和消化的作用，可增加细菌的侵袭力。荚膜不易被普通染色法染色，需经特殊染色法染色后才能着色，易于观察。本实验要求学生了解特殊染色法并认识这种细菌特殊构造。
【材料】
①经腹腔接种肺炎链球菌后死亡的小白鼠
②结晶紫染液
③20％硫酸铜溶液
④解剖器材
⑤滤纸片
【方法】
1．涂片
解剖小白鼠，取小白鼠脏器(肺、肝、脾和肾)、心血或腹腔液涂片，空气中干燥，火焰固定。
2．染色
①取一滤纸片覆盖于涂膜上，滴加结晶紫溶液，并在火焰上略加热至出现蒸气为止(约1min)。
②倾去染液，除去滤纸片，用20％硫酸铜溶液冲洗。用滤纸吸干后镜检。
【结果观察】
此荚膜染色为黑斯(Hiss)氏染色法，荚膜呈淡紫色，菌体呈紫色。在小白鼠组织细胞周围，有散在成对的小尖矛形的紫色细菌，细菌周围有一淡紫色的亮圈，即为荚膜。
2．抗酸染色液
3．3%盐酸酒精
4．碱性美兰染液
5．生理盐水
6．滤纸片
7．载物玻片，接种环等。
【方法】
1．涂膜
痰的涂片：用灭菌的接种环采取痰中干酪样坏死的小块或带血的痰液，在载物片上涂成薄而均匀的膜，灼烧接种环灭菌（在灼烧接种环时为防止痰中的细菌溅出，可先将接种环在内焰烧干，然后再于外焰中灭菌）。
细菌斜面培养物的涂片，与革兰氏染色法相同。
②户田氏染色液
③蒸馏水
④载物玻片(用清洁液浸泡过的)
【方法】
1．涂片
无菌取一接种环细菌，使其游散于少量蒸馏水中，制成细菌浮游液，然后取一滴细菌浮游液轻轻做成涂膜，自然干燥。
2．染色
滴加户田氏染色液，染色0.5～5min，水洗，吸干，镜检。
wk.baidu.com【结果观察】
此方法为户田氏染色法，鞭毛和菌体皆染成紫红色。伤寒杆菌是周身带有鞭毛的杆菌。尚可见脱落鞭毛的菌体和已脱落游离的鞭毛，这是由于人工处理标本的结果。鞭毛很细，经染色处理后，鞭毛和菌体都比实际粗大。
2．干燥与革兰氏染色法相同。
3．固定与革兰氏染色法相同。
4．染色
①在已固定好的涂片上放置滤纸片（滤纸的作用是滤去染液中的沉渣，使标本清晰），滴加抗酸染液于滤纸片上，将整个滤纸片滴满。
②将加有染液的滤纸片加温：在火焰上方保持一定高度，加热至出现蒸气（注意不能使染液沸腾），如此反复2~3次（约5min）。在加热过程中要防止将染液烘干，应及时添加染液。
项目4：特殊染色法
【目的要求】
1、了解抗酸染色法、荚膜染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法的原理
2、熟悉抗酸染色法、荚膜染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法的方法以及意义
【实验内容】
一、抗酸染色法
本实验要求同学掌握抗酸染色法的基本操作技术。了解此方法对分枝杆菌属（Mycobacterium）鉴别的重要意义。
【原理】
（二）Moeller氏芽胞染色法
经火焰固定的细菌涂片，以5％铬酸水溶液处理2~10min，充分水洗。用石碳酸复红染液加热染色1min，水洗。用5％硫酸水短时间脱色(约5s)，立即水洗。再用美蓝染液染色半分钟，水洗，吸干，镜检。结果芽胞染成红色，菌体染成蓝色。
【原理】
用着色性强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅可以进入菌体也可进入芽胞内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽胞一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽胞仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽胞囊被染成复染剂的颜色，使芽胞和菌体更易区别。
(一)威-康(Wiltz—Conkln)二氏芽胞染色法
1．抗酸染色液的制备
称取碱性复红10g研磨，95%酒精溶解后终体积为100ml，制成复红酒精饱和液，再取此饱和液10ml与5%石炭酸水溶液90ml混合，用滤纸过滤即可使用（此染液与革兰氏染液所用的石炭酸复红液不同之处是不需10倍稀释）。
2．碱性美兰染液
首先取美兰5~7g和100ml酒精制成美兰酒精饱和液，再取美兰饱和液30ml，与0.1%氢氧化钾水溶液100ml混合，用滤纸过滤即成（此溶液越陈旧，染色效果越好）。
③去掉滤纸片，待玻片冷却后，水洗。
④用3%盐酸酒精脱色，直到流下的液体无色为止，进行水洗。
⑤用碱性美兰染液复染30s，水洗，干燥，镜检。
【结果观察】
结核杆菌染成红色，细长、直的或微弯曲杆菌，偶尔有杆菌着色不均，呈颗粒状者。标本的其余部分及非抗酸性细菌染成兰色。必须逐一观察各个视野，直到全部涂片找不到结核杆菌时，才可报告阴性。
【附录】
户田氏染色液的制法：
甲液明矾饱和水溶液2份
5％石碳酸水溶液5份9份
20％鞣酸水2份临用前混合，过滤。
乙液碱性复红酒精饱和液1份
四、芽胞染色法
芽胞(Spore)是细菌的休眠状态，对各种理化因素有强大的抵抗力，能耐受恶劣环境的影响。芽胞折光性很强，可经特殊染色法染色后，在光学显微镜下观察。本实验要求学生了解两种特殊染色法并认识这种细菌特殊构造。
抗酸性细菌如结核杆菌等分枝杆菌属细菌，细菌细胞壁有很多脂类物质，石碳酸复红加温染色后，其中的分枝菌酸与石碳酸复红结合成牢固的复合物，能够抵抗盐酸酒精的脱色，使菌体保留红色，故称抗酸染色法。
其他非抗酸菌和组织细胞因不能抵抗盐酸酒精的脱色，被脱成无色，后经碱性美兰染色后染成兰。
【材料】
1．结核病人的喀痰或卡介苗
三、鞭毛染色法
【原理】
鞭毛(Flagella)是细菌的运动器官。细菌的鞭毛很纤细，直径仅20nm，不能用普通显微镜观察，不易被普通染色法染色，只有经特殊染色处理，增加鞭毛直径，才能在光学显微镜下观察。本实验要求学生了解这种特殊染色法并认识这种细菌特殊构造。
【材料】
①伤寒杆菌斜面纯培养物(注：系首先将细菌在肉汤中多次传代，然后移种于加少量蒸馏水的琼脂斜面培养基上，37℃培养7~16h)。
【材料】
①破伤风杆菌24h琼脂斜面纯培养物
②3％孔雀绿水溶液
③0.5％花红水溶液
④载物玻片
【方法】
1．取破伤风杆菌培养物涂膜、干燥、火焰固定。
2．滴加3％孔雀绿水溶液加热染色3～6min，水洗。
3．0.5％花红水溶液复染0.5～1min，水洗，干燥，镜检。
【结果观察】
芽胞染成绿色，菌体染成红色。
注意芽胞的形状、在菌体中的位置和大小(与菌体横径比较)。同时可能看到没有芽胞的繁殖体和失掉菌体的芽胞。
二、荚膜染色法
细菌的荚膜(Capsule)具有保护细菌抵抗吞噬和消化的作用，可增加细菌的侵袭力。荚膜不易被普通染色法染色，需经特殊染色法染色后才能着色，易于观察。本实验要求学生了解特殊染色法并认识这种细菌特殊构造。
【材料】
①经腹腔接种肺炎链球菌后死亡的小白鼠
②结晶紫染液
③20％硫酸铜溶液
④解剖器材
⑤滤纸片
【方法】
1．涂片
解剖小白鼠，取小白鼠脏器(肺、肝、脾和肾)、心血或腹腔液涂片，空气中干燥，火焰固定。
2．染色
①取一滤纸片覆盖于涂膜上，滴加结晶紫溶液，并在火焰上略加热至出现蒸气为止(约1min)。
②倾去染液，除去滤纸片，用20％硫酸铜溶液冲洗。用滤纸吸干后镜检。
【结果观察】
此荚膜染色为黑斯(Hiss)氏染色法，荚膜呈淡紫色，菌体呈紫色。在小白鼠组织细胞周围，有散在成对的小尖矛形的紫色细菌，细菌周围有一淡紫色的亮圈，即为荚膜。
2．抗酸染色液
3．3%盐酸酒精
4．碱性美兰染液
5．生理盐水
6．滤纸片
7．载物玻片，接种环等。
【方法】
1．涂膜
痰的涂片：用灭菌的接种环采取痰中干酪样坏死的小块或带血的痰液，在载物片上涂成薄而均匀的膜，灼烧接种环灭菌（在灼烧接种环时为防止痰中的细菌溅出，可先将接种环在内焰烧干，然后再于外焰中灭菌）。
细菌斜面培养物的涂片，与革兰氏染色法相同。
②户田氏染色液
③蒸馏水
④载物玻片(用清洁液浸泡过的)
【方法】
1．涂片
无菌取一接种环细菌，使其游散于少量蒸馏水中，制成细菌浮游液，然后取一滴细菌浮游液轻轻做成涂膜，自然干燥。
2．染色
滴加户田氏染色液，染色0.5～5min，水洗，吸干，镜检。
wk.baidu.com【结果观察】
此方法为户田氏染色法，鞭毛和菌体皆染成紫红色。伤寒杆菌是周身带有鞭毛的杆菌。尚可见脱落鞭毛的菌体和已脱落游离的鞭毛，这是由于人工处理标本的结果。鞭毛很细，经染色处理后，鞭毛和菌体都比实际粗大。
2．干燥与革兰氏染色法相同。
3．固定与革兰氏染色法相同。
4．染色
①在已固定好的涂片上放置滤纸片（滤纸的作用是滤去染液中的沉渣，使标本清晰），滴加抗酸染液于滤纸片上，将整个滤纸片滴满。
②将加有染液的滤纸片加温：在火焰上方保持一定高度，加热至出现蒸气（注意不能使染液沸腾），如此反复2~3次（约5min）。在加热过程中要防止将染液烘干，应及时添加染液。
项目4：特殊染色法
【目的要求】
1、了解抗酸染色法、荚膜染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法的原理
2、熟悉抗酸染色法、荚膜染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法的方法以及意义
【实验内容】
一、抗酸染色法
本实验要求同学掌握抗酸染色法的基本操作技术。了解此方法对分枝杆菌属（Mycobacterium）鉴别的重要意义。
【原理】
（二）Moeller氏芽胞染色法
经火焰固定的细菌涂片，以5％铬酸水溶液处理2~10min，充分水洗。用石碳酸复红染液加热染色1min，水洗。用5％硫酸水短时间脱色(约5s)，立即水洗。再用美蓝染液染色半分钟，水洗，吸干，镜检。结果芽胞染成红色，菌体染成蓝色。
【原理】
用着色性强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅可以进入菌体也可进入芽胞内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽胞一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽胞仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽胞囊被染成复染剂的颜色，使芽胞和菌体更易区别。
(一)威-康(Wiltz—Conkln)二氏芽胞染色法