重组子的筛选与鉴定

限制性酶切割
限制片段 琼脂糖电泳
DNA分子
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶 滤膜
转膜 吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
凝胶
玻 滤 璃 纸 板
尼龙膜
滤纸
白瓷盘
吸水纸
玻璃板
重物
吸水纸转膜
。
真空转膜
尼 滤 龙 纸 膜
二、酶切电泳筛选法 1. 原理：
根据已知的外源DNA 序列的限制性酶切 图谱，选择一两种 内切酶切割质粒， 电泳后比较电泳结 果（DNA带数和长 度）。
或用合适的内切酶切 下插入片断，再用其 它酶切这个片断，电 泳后比较结果是否符 合预计的结果。
二、分子检测法
PCR扩增检测 分子杂交检测
PCR扩增检测法 1. 原理
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保
留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被 环丝氨酸杀死。
1.插入失活筛选: 例2 在Lac Z中插入目的基因
pUC18/19
lacZ与蓝白斑筛选
-互补 (alpha-complementation)
载体上带有一个来自大肠杆菌的 lac操纵子的DNA区段，可 编码β-半乳糖苷酶氨基端即α—肽链， IPTG可以诱导该片段 的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端 互补(α-互补)。 故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码 lacZ的质粒可同时合 成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal的培养基上生长 形成蓝色茵落。 将一连串克隆位点克隆入质粒的lacZ基因中，外源DNA插入 质粒的多克隆位点后可使β-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从 而破坏了α-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色 菌落。 利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中 筛选出来。这种现象被称为是 -互补 X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 IPTG:(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)
有白色 菌斑生 长
2、 根据插入基因的遗传表型筛选
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。 一、原理： 弥补缺陷 转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
受体菌： his 外源基因： + his
在不含组氨酸的 培养基中生长
三、物理检测法
DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分 子量大。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆中分离 质粒，电泳、比较其分子量。
分子量 Marker
重 组 克 隆
载体
根据重组DNA分子大小鉴定重组子 原理：有外源DNA片段插入载体后的 重组DNA与载体DNA之间的大小差异。 基本方法：提取转化子的DNA，经 琼脂糖凝胶电泳分离，电泳迁移慢的带是 重组DNA的带。 此法是对重组子进行分析鉴定的最基 本、最简单的方法，只适用于重组子的初 步鉴定。
无水乙醇 离心 酚/氯仿 蛋白酶K SDS
tissue
Paper Towels
2. Northern blotting 用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。 主要检测插入片 断是否被转录。 从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
4.1 Southern 印迹杂交
此技术由Southern 1975年首先设 计。被检测对象为DNA。
（1）菌落印记原位杂交筛选 特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
Southern blotting 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。
从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能 与探针杂交，在底片上曝光显示。
Southern Blotting
（3）二抗结合
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 抗冲洗掉。二抗只识别一抗。
二抗
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物 酶、脲酶等）。
（4）显色反应 加入无色的底物，被二抗上所带的酶催 化反应转变成有色物质（或发光）。
（5）比色 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打 印出结果。
3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
补充
PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断作PCR引物。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。
（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
例 PCR检测
PCR检测外源基因的原理是根据被转移的外源基 因（目的基因或选择标记基因）设计引物，扩增外源 基因的片段。如果扩增出的片段与设计的一对引物之 间的实际片段在长度上相吻合，说明基因已转入受体 细胞。 在进行PCR检测时应设两个对照：阳性对照即质粒 DNA和阴性对照即非转基因材料的DNA。 PCR扩增结果只能初步确定转基因材料的真实性， 并不能完全确信。容易出现假阳性，通常需要进一步 用Southern杂交才能证实。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （Polyacrylamide gel electrophoresis）
电泳buffer
在电场的作用下线性 蛋白质链在聚丙烯酰 胺凝胶介质中向正极 移动，移动的速率主 要取决于其分子量大 小（链的长短），从 而把不同分子量的肽 链分开。
电泳buffer
点样
电泳方向
转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的 PCR扩增结果（M为分子量标准，C为非转 基因植株，P为质粒对照，1-20为转基因植 株）
四、核酸分子杂交技术
核酸分子杂交的基本原理 变性 复性
DNA-DNA 杂交双链分子 • 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下
按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列且已标记的DNA或RNA,称探针。
检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
质粒基因A
插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 持滤膜
固相支 抗A抗体质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体 持滤膜 发光，底片曝光
125I标记的
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。
1. 原理 抗原——抗体凝集反应。 2. 方法
•
杂交有固一液相杂交和液相杂交。
2.1 探针（Probe)的概念:
一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA 特异互补的已知核苷酸序列。
四、原位杂交 1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组 织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据探针与待 检核酸分：Dห้องสมุดไป่ตู้A/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂 交
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无 色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
第六节 重组体的筛选与鉴定
• 转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 • 重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。
DNA的体外重组
外源DNA 载体DNA
连接 重组分子
转化或转导 电穿孔或显微注射
原核细胞
受体细胞 真核细胞
表达
扩增或表达
植物转化体报道基因筛选法 1. 报告基因（reporter gene) （1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。 （4）其它
125I标记的二抗
125I 标记的二 固相支 待测基因 一抗 二抗 抗结合蛋白 持滤膜 产物蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 一抗 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 一抗 二抗 产物蛋白
125I
标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
3. Broome-Gilbert双位点检测法
无菌斑 生长
质粒转化 的受体菌
-半乳糖苷酶的 缺失被载体产物 互补，能分解 Xgal。且有抗菌 素抗性
载体产物失活， 不能互补-半 乳糖苷酶的缺 失。不能分解 Xgal，但有抗 菌素抗性
在含抗菌素 和Xgal的培 养基上培养
有蓝色 菌斑生 长
带外源DNA插 入的质粒转化 的受体菌
在含抗菌素 和Xgal的培 养基上培养
几种报道基因的作用原理
紫外光照
GFP
发绿色荧光 GUS 荧光产物
4-甲-β-D-葡糖醛酸
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸 GUS 蓝色水解产物
Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP
转入萤火虫 的luciferase 的烟草
原理：
在质粒固有 的功能基因 内插入目的 基因，则该 基因不能表 达有功能的 蛋白质。
Ampr
两种抗生素直接筛选（影印法）
1 2
3
1 2
3
4 5
6
4 5
6
Amp
Tet
3和5 是阳性克隆
环丝氨酸辅助筛选
无环丝氨酸培养基
pBR322抗菌素标记选择原理
（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因：产生-内酰胺酶， 使氨苄青霉素转变为青霉酮酸 （3）环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停 止生长的细菌。 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基 因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选 择重组克隆。
-互补 (alpha-complementation)
IPTG诱导的结果：
MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道 是否有DNA插入。
无质粒的 受体菌
-半乳糖苷酶 部分缺失，不 能分解Xgal； 无抗菌素抗性
在含抗菌素 和Xgal的培 养基上培养
凝胶
真空转膜槽
+
盖子
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”
利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法 1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
固相支 待测基因 一抗 持滤膜 产物蛋白
最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）
临床检验常用的单抗
四、免疫印迹（western blotting）法
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方 法检测胶上的蛋白质泳带。
1.原理： （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）： ① SDS: 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的 蛋白质维持线性状态，并与蛋白质 结合，使蛋白质带上负电荷。
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成 “沉淀圈”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
酶
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察 19
2. ELISA检测的一般步骤 （1）固定样品
将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后 就被固定在孔底。
孔底
（2）一抗结合 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗
一、遗传检测法
重组子的筛选与鉴定
报告基因筛选、 抗性标志插入失活筛选、 半乳糖苷酶蓝白斑筛选、 插入基因遗传性状筛选、
平板筛选
二、分子检测法
PCR扩增检测 分子杂交检测 三、物理检测法 DNA电泳检测 限制酶酶切分析法 四、免疫化学检测法 五、核酸序列分析
一、遗传学检测法
重组体的筛选与鉴定---筛 1.插入失活筛选: 例1 在Tetr中插入目的基因
③蛋白质电泳的分子 量标准 已知分子量的蛋白质 混合液，与待测样品 一起电泳，为样品蛋 白质提供分子量估计。 商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为6×1023道尔顿
Da
Dalton
SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色：