转谷氨酰胺酶活性基团研究

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１］。它可通过胺的导入、成共价化合物的聚合酶［交联以及脱
不仅可以通过引入赖氨酸等氨基酸胺３种途径改性蛋白质，而提高蛋白质的营养效价，还能改善食品的功能特性，延长
２－４］。货价期以及减少食品中的过敏源［
酶的小分子修饰是用小分子修饰剂共价修饰酶，使酶的稳定性提高。利用小分子化合物对酶的活性部位及活性部
（黑龙江哈尔滨１１．哈尔滨商业大学黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，５００７６；）哈高科大豆食品有限责任公司，黑龙江哈尔滨１２．５００７８（１．ＫｅＬａｂｏｒａｔｏｒｏＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｉｎｅｅｒｉｎａｒｂｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｏＣｏｍｍｅｒｃｅ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｉａｎｙｙｆｇｇ，Ｈｙｆｇｊｇ，Ｈ１５００７６，Ｃｈｉｎａ；２．ＨａｒｂｉｎＨｉ－ＴｅｃｈＳｏｂｅａｎＦｏｏｄＣｏ．Ｌｔｄ．ａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｉａｎ５００７８，Ｃｈｉｎａ）ｙｇｊｇ１、、、摘要：采用ＰＭＳＦ、ＮＢＳＩＡｃＢｒＡｃＳＵＡＮ、ＮＥＭ、ＤＴＴ、ＮａＳＯ３、ＥＤＣ、ＷＲＫ１０种化学修饰剂在一定的条件下选择２性修饰转谷氨酰胺酶，研究转谷氨酰胺酶分子中氨基酸侧链、、基团与酶活性中心的关系。结果表明：ＰＭＳＦ、ＮＢＳＩＡｃ、而ＢｒＡｃＳＵＡＮ、ＮＥＭ等化学修饰剂能显著抑制酶活力，说明丝氨酸残ＤＴＴ、ＮａＳＯ３、ＥＤＣ、ＷＲＫ对酶活影响不大，２基、色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基、半胱氨酸残基对酶活力影响很大，位于酶的活性中心，二硫键、谷氨酸（天冬氨酸）残基对酶活几乎没有影响，不位于酶的活性中心。关键词：转谷氨酰胺酶；化学修饰；活性中心
” ）基金项目：国家 “ 计划项目（编号：８６３２００８ＡＡ１０Ｚ３０３，作者简介：马永强（男，哈尔滨商业大学教授，硕士。１９６３－）：Ｅ－ｍａｉｌｍａｒｂｃｕ．ｅｄｕ．ｃｎ＠ｈｙｑ收稿日期：２０１１－０３－１５
转谷氨酰胺酶（全称为蛋白质－谷氨ＴＧ；ＥＣ２．３．２．１３；酰胺 γ 是一种能催化转酰基反应，催化－谷氨酰胺基转移酶）蛋白质中赖氨酸上的 ε －氨基和谷氨酸上的 γ －羟酰胺基之间的结合反应，从而导致蛋白质（或多肽）之间发生共价交联形
５］。修位外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶的一些性质［
饰剂主要修饰酶表面的以下基团：－ＣＯＯ－、－ＮＨ３＋、咪唑基等。蛋白质化学修饰是研究酶的活性－ＳＨ、－ＯＨ、探明酶必需基团组成的一个有效办法，利用这一方法中心，迄今已获得了大量有关酶的结构与功能的信息，在一定条件下采用特定氨基酸修饰剂对酶的氨基酸侧链基团进行修饰可确定其活性功能集团，并且修饰过的酶稳定性优于原
６－８］。虽然这一修饰方法已经得到广泛的应用，酶［但是对于
转谷氨酰胺酶的小分子修饰，目前国内外都未对其进行研究。本试验采用小分子修饰的方法对转谷氨酰胺酶进行修饰，从而确定其活性基团。
１材料与方法
１．１材料转谷氨酰胺酶：江苏泰兴一鸣精细化工有限公司。
１．２试剂，），），苯甲基磺酰氟（溴乙酸（碘乙酸（ＰＭＳＦ）ＢｒＡｃＩａｃＮ－，：乙基马来酰亚胺（分ＮＥＭ）ＷｏｏｄｗａｒｄｓｒｅａｅｎｔＫ（ＷＲＫ）ｇ析纯，上海晶纯试剂有限公司；）：分析纯，上海化学试剂采购ＮＮＢＳ－溴代琥珀酰亚胺（
供应五联化工厂；：琥珀酸酐（分析纯，天津市光复精细化工研ＳＵＡＮ）究所；
７
基础研究
100
Fra Baidu bibliotek
２０１１年第４期
：二硫苏糖醇（分析纯，国药集团化学试剂有限ＤＴＴ）公司；亚硫酸钠：分析纯，天津基准化学试剂有限公司；：碳化二亚胺（分析纯，上海晶纯试剂有限公司。ＥＤＣ）１．３主要仪器紫外可见分光光度计：上海光谱仪器Ｓｅｃｔｒｕｍ７２２Ｅ型，ｐ有限公司；，恒温水浴锅：天津市欧诺仪器仪表有限公司。ＳＹ２４－－１．４试验方法１．４．１酶活测定方法采用Ｆｏｌｋ等报道的分光Ｈｄｒｏｘｙ－ａｍａｔｅ分析法
第２７卷第４期２０１１年７月
／．ｉｓｓｎ．１００３－５７８８．２０１１．０４．００２１０．３９６９ｊ
ＯＯＤ＆ＭＡＣＨＩＮＥＲＹ
食品与机械
Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．４Ｊｕｌ．２０１１
100
／测定。试剂Ａ：含０．１ｍｏｌＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲
相对酶活 Relatively enzyme activity/%
），／／液（Ｈ＝６．００．１ｍｏｌＬ羟胺，０．０１ｍｏｌＬ还原型谷胱甘肽ｐ／／及０试剂Ｂ：．０３ｍｏｌＬＮＢＺｌｎｌ３ｍｏｌＬ－ α －Ｃ－Ｇｙ的混合液；－Ｇ，／溶解于０．ＨＣｌ１２％三氯乙酸及５％ＦｅＣｌ６Ｈ２Ｏ（１ｍｏｌＬ３· 等体积混合。试剂Ａ在３ＨＣｌ中）７ ℃ 与酶液反应１０ｍｉｎ后，／添加试剂Ｂ终止酶反应并形成红色铁化合物，在４０００ｒｍｉｎ的转速下离心１上清液于５５ｍｉｎ除去沉淀，２５ｎｍ测定吸光用Ｌ度，Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄγ ｏｎｏｈｄｒｏｘ－谷氨酸 γ －单羟肟酸（－ｍｙ－）做标准曲线。１单位转谷氨酰胺酶酶活力单位定ａｍｉｃａｃｉｄ义为：３７ ℃ 每分钟产生１μ ｍｏｌＬ－谷氨酸 γ －单羟肟酸所需酶／。量（ＵｍＬ）相对酶活：以相同条件下所测定的最高酶活力定义为其余与之相比所得的数为相对酶活。１００，加１．４．２转谷氨酰胺酶最适ｐＬ酶液，Ｈ值研究吸取１ｍ入到具塞试管中，再加入２ｍ于Ｌ０的Ａ试剂，Ｈ值为２～１ｐ，取出立即加入２ｍ３７ ℃ 水浴反应１０ｍｉｎＬＢ试剂终止酶反平行测定３次，取其平均应。于５２５ｎｍ波长测定其吸光值，值，计算其酶活力。以温度为横坐标，相对酶活为纵坐标作得出转谷氨酰胺酶的最适ｐ图，Ｈ值。、、１．４．３转谷氨酰胺酶的小分子修饰将ＰＭＳＦ、ＮＢＳＩＡｃ、ＢｒＡｃＳＵＡＮ、ＮＥＭ、ＤＴＴ、ＮａＳＯ３、ＥＤＣ和ＷＲＫ１０种修饰２
［９］
相对酶活 Relatively enzyme activity/%
80 60 40 20 0 2 4 6 8 10 pH
图１转谷氨酰胺酶最适ｐＨ值的研究Ｆｉｕｒｅ１ＴｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｒａｎｓｌｕｔａｍｉｎａｓｅｇｇｏｔｉｍａｌＨｖａｌｕｅｐｐ
：ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｔｒａｎｓｌｕｔａｍｉｎａｓｅｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｍｏｄｉｆｉｅｄｂｔｅｎｇｙｙ，，ｒｅａｅｎｔｓｓｕｃｈａｓＰＭＳＦ，ＮＢＳ，ＩＡｃＢｒＡｃＳＵＡＮ，ＮＥＭ，ｃｈｅｍｉｃａｌｇＤＴＴ，ＮａＳＯＥＤＣ，ＷＲＫ，ｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．Ｉｔｃａｎｂｅｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｐｙ２３，ｅｎｚｍｅａｃｔｉｖｉｔｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌａｆｔｅｒｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｙｙｇｙ，，ＰＭＳＦ，ＮＢＳ，ＩＡｃＢｒＡｃＳＵＡＮ，ＮＥＭ，ｂｕｔｏｏｓｉｔｅｌｔｈｅＤＴＴ，ｐｐｙＮａＳＯＥＤＣａｎｄＷＲＫｄｉｄｎｔｏｂｖｉｏｕｓｌａｆｆｅｃｔｔｈｅｔｒａｎｓｌｕｔａｍｉｎａｓｅｙｇ２３，ｅｎｚｍｅａｃｔｉｖｉｔ．Ｓｔｕｄｏｆｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｙｙｙ，Ｔ，Ｈ，ｔｈａｔｔｈｅＳｅｒｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓｒｔｏｈａｎｒｅｓｉｄｕｅｓｉｓｔｉｄｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓｙｐｐＬｓｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓａｎｄＣｓｔｅｉｎｌｒｅｓｉｄｕｅｓｗｅｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｙｙｙ，ｒｏｕｓｉｎｓｉｄｅｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｌｕｔａｍｉｎａｓｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅｇｐｇ）ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄａｎｄＧｌｕｔａｍａｔｅ（Ａｓａｒｔａｔｅｒｅｓｉｄｕｅｓｄｉｄｎｔｓｕｅｓｔｅｄｐｇｇｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｌａｆｆｅｃｔｔｈｅｅｎｚｍｅａｃｔｉｖｉｔａｎｄａｒｅｎｏｔｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｅｎｇｙｙｙ－ｚｍｅａｃｔｉｖｅｓｉｔｅ．ｙ：；；Ｋｅｗｏｒｄｓｔｒａｎｓｌｕｔａｍｉｎａｓｅｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｇｙ
转谷氨酰胺酶活性基团研究
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｌｕｔａｍｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｒｏｕｓｇｙｇｐ马永强１岳文静１张娜１张毅方２钱镭１刘颖１
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