纤维素酶活性测定

纤维素酶活性测定
技术报告NERL/TP-510-42628 2008年1月实验室程序分析发行日期：1996年8月12 日
B. 阿德尼和J. 贝克
科罗拉多州科尔大道戈尔登国家可再生能源实验室1617，80401-3393303-275-3000• 美国能源部办公室的能源效率和可再生能源由中西部研究所•巴特尔主持。

合同号：DE - AC36 - 99 - GO10337
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纤维素酶活性测定
技术报告
1。

简介
1.1下面的方法介绍了纤维素酶的活性测定过程采用国际纯粹化学与应用化学的指导方针。

该过程已被设计用来测量在“过滤条件下纤维素酶的活性单位”（FPU）的原始酶液。

对于酶制剂的定量结果进行比较，必须在此基础上进行重要的和平等的转换。

2.0毫克血糖的价值相当于从50毫克的过滤纸在60分钟（4％的转换）已被指定为计算所的IUPAC的滤纸纤维素酶单位（FPU）的拦截的还原糖。

1.2这是极为重要的一点，要记住：FPU的定义只是在这个意义上的转换。

还原糖产量不是在检测的混合物中线性函数酶的数量，而是由高斯讨论（1987年），两倍的酶不会在相等的时间被预期得到两倍还原糖的产率。

因此该检测程序需要找到一种稀释原始的酶原料，比如一个0.5毫升稀释液在60分钟内稀释催化4％（或者，在实践中，发现两个稀释支架上的4％转换点，使之密切合作，所需的稀释可以
得到合理的精度，有插值），然后计算符合稀释要求原活动（浮点运算单元/毫升）。

进一步评价所需的计算，其重要意义，要在附录中找到。

1.3测定混合物时，可能在某些情况下含有还原糖与底物蔗糖水解酶。

将发酵液的检测纤维素酶可能含有营养糖，纤维素和还原端基体聚合物的有时在任何酶的攻击下是可以衡量葡萄糖的量。

出于这个原因，控制包括酶无需底物和酶的底物，不包括所有酶检测值与样品空白值的任何修正。

2。

范围
2.1本程序只用于浮点运算单元，在一个适当的活性中，测定纤维素酶的制备过程的IUPAC定义如上所述。

3。

参考文献
3.1高斯，T.K. 1987。

“测量纤维素酶的活动。

”纯净代谢。

化学。

59：257-268。

3.2米勒，G.L.1959 “利用二硝基水杨酸试剂测定还原糖。

”分析化学。

31:426-428。

4。

意义和使用
4.1这个步骤根据IUPAC（国际理论和应用化学联合会）理论，决定了在纤维素酶的准备工作中酶活动的滤纸功效。

5。

装置设备
5.1保持在500C范围内的水浴。

5.2 能测量540nm吸光度的分光光度计。

6。

试剂和反应物
6.1蒸馏水1416ml
二硝基水杨酸10.6g
氢氧化钠19.8g
混合溶解上述物质，然后添加罗谢尔盐306g
苯酚7.6ml（在500C时溶解）
焦亚硫酸钠8.3g
将3ml样品混合着0.1N盐酸滴到酚酞的末端，它将需要5-6ml盐酸，如果需要，添加氢氧化钠。

6.2柠檬酸盐缓冲溶液：对于里氏木霉纤维素酶，在PH值为4.8的0.05M柠檬酸盐缓冲溶液中执行纤维素酶鉴定。

对于其他纤维素酶，PH值和温度可能会不同。

当报告结果时，鉴定的条件一定是明确的。

柠檬酰胺210g
去离子水750ml
添加氢氧化钠直至PH为4.3
在溶液中加水冲淡至1L，然后测其PH。

如果需要，在溶液中加入氢氧化钠至PH值为4.5.当1M柠檬酸盐缓冲溶液用水冲淡至50mM，那么它的PH应该为4.8.在冲淡柠檬酸钠缓冲溶液至PH为4.8时，检测和适应它。

7。

思考与尝试
7.1追随合适的特定的卫生计划方针的NREL实验室。

7.2 当使用有毒的，腐蚀的苯酚时，一定要小心。

8。

使纤维素糖化的滤纸分析的步骤
8.1通过类似的和完全相同的三类试验方法发现的糖苷键分裂为下面讲述的细节作了准备。

这种酶作用物是一种高级滤纸条
（1.0cm*6.0cm）。

8.2酶的试管化验
8.2.1在每个13*100的试管中放置一张卷的滤纸。

8.2.2 将1.0ml，PH为4.8的0.05M的柠檬酸钠加入试管中，缓冲溶液应该使滤纸饱和。

8.2.3 使令缓冲溶液的试管和酶作用物相互平衡，都达到50O C。

8.2.4 在柠檬酸盐缓冲溶液中加入0.5ml稀释的酶，至少两种稀释溶液必须由酶样品制成，一种稀释溶液释放超过2m的葡萄糖，另外一种少于2mg。

这两种稀释溶液把释放2.1和1.9mg葡萄糖作为目标，依赖于酶，这种目标实现比较困难，额外的稀释溶液必须使用。

8.2.5 在50O C环境下培养60min。

8.2.6 在培养最后阶段，将试管从50O C水浴中移出，通过和加入
3mlDNS试剂并与溶液混合使酶停止反应。

8.3试剂和反应物
8.3.1试剂溶液：1.5ml柠檬酸盐缓冲溶液。

8.3.2酶控制：1.0ml柠檬酸盐缓冲溶液+0.5ml稀释的酶（为每个稀释溶液准备一个独立的控制）。

8.3.3酶作用物控制:1.5ml柠檬酸盐缓冲溶液+滤纸条。

8.4葡萄糖标准
8.4.1无水葡萄糖的库存解决方案应该制定部分这些存货应该密封
和冷藏在融解并确保充分混合后，这种标准应该是旋涡。

8.4.2稀释溶液在以下方式中的库存制成的。

1.0ml+0.5ml buffer=1:1.5=6.7mg/ml(3.35mg/0.5ml)
1.0ml+1.0ml buffer=1:2=5mg/ml(
2.5mg/0.5ml)
1.0ml+
2.0ml buffer=1:3=6.7mg/ml(1.65mg/0.5ml)
1.0ml+4.0ml buffer=1:1.5=2mg/ml(1.0mg/0.5ml)
8.4.3含有1.0ml柠檬酸钠缓冲溶液的应该通过在13*100mm的试管中加入0.5ml葡萄糖缓冲溶液来准备葡萄糖标准试管。

8.4.4应该在50O C时和酶化验试管一起培养，然后在60O C时通过加入3.0mlDNS试剂停止培养。

8.5发展（Miller,1959）
8.5.1在含有足够水的持续沸腾的水浴中加热所有试管5min来覆盖部分被混合着试剂的反应物占有的试管，所有的样品应该一起煮沸。

在煮沸后，移至冰水浴。

8.5.2让试管静置直至产生沉淀，用离心机器简单分离，在水中冲淡所有试管。

通过测量吸光度决定颜色的形成。

这种在上面描述的稀释的吸光度应该在0.1到1.0A。

9。

结果
9.1利用过量的葡萄糖（mg/0.5ml）搭配A540构建葡萄糖标准的线性曲线，标准曲线的数据应密切符合适当的直线，直线的关联系数是最接近的那一个。

验证标准曲线通过运行一个校准验证的直线，
一种独立的，准备好的溶液，里面包含已知量的葡萄糖浓度为标准曲线上的一半。

9.2使用此标准曲线确定的葡萄糖量为每个样品试管在减去空白的酶之后得出来的。

9.3估计将2.0mg的葡萄糖的酶浓度和一大块葡萄糖酶浓度的对数做比较。

（请参考附录B，就是使用半对数方格纸）。

为了找到要求的酶的浓度，两份数据指出需要非常接近 2.0ml，然后在它们之间画一条路线，使用此线两点之间找到稀释的酶，将产生和2.0mg葡萄糖等价的还原糖，附录B提供了一个例子：
在这个部分，在下面计算FPU的等式中，酶浓度在这个术语是指在酶稀释溶液中原来酶所占的比例。

9.4计算FPU
FPU=0.37/(酶)2.0mg葡萄糖
在公式中，酶代表了在直接测试酶稀释溶液里面的原来的酶的比重，由此引出的FPU见GHOSE（1987）和附录A。

9.5用IUPAC-FPU计算一个例子涉及附录B。

10。

精度和偏差
10.1精度的测量只有精确的重复测量相同的数量的酶。

这个过程,如果仔细地进行,应该像得到其他实验室使用相同的过程那样得到同样的近似数字读数。

用滤纸检测的精度可能受固有的纤维素酶制剂的物理特性的影响。

11。

质量控制
11.1报道有象征意义的数字:典型的效果显著的统计报告作为整个整数和标准差。

报道之前必须明确检测条件的结果。

11.2重复:配制每个稀释溶液,一式三份。

11.3空白:所描述的那部分“空白和控制”。

11.4标准:不是百分之相对不同定义,依赖于这种被测试的酶。

11.5方法:不可自审核标准酶随时间变化。

11.6标准检定校准:校准标准应独立标定及分析所描述的那部分“计算”。

11.7样本大小:依赖于酶浓度。

11.8样本贮存:根据样本酶的来源及厂商的使用说明。

11.9贮存: 标准储存在-20oC或准备新鲜的批次,请在使用前用力的摇匀。

11.10标准:所描述的那部分“葡萄糖水平”。

11.11定义了一批:各种标准、空白及样品在一起。

由于通过工具约束这批样品的大小是有限的,不应大于实际处理的标准大小。

11.12控制图:不适用。

11.13其他:不适用。

12。

附录A:在方程的数值用于计算,滤纸的活动
实际的底线是,如果使用按照说明的指示,这些计算进行了计算公式,在获得的结果一致公认的活动,在“滤纸单位”,将会得到在世界上其它实验室,是这些酶解试题。

对于那些工人感兴趣的这个方程,推导出的“滤纸单位”, 结合Ghose(1987)，下面的意见可能是有益的。

分子(0.37)方程的系数为转换。

2.0毫克的葡萄糖水准产生的分析方法,葡萄糖(2.0÷0.18016),从量的测试,用于检测(0.5毫升),并由溶解时间(60分钟)所需的减少。

因为在分母上“酵素浓度”是一种无量纲化方程的数量(等于比例的酶素浓度在0.5毫升的酶稀释加入检测到这种酶浓度,原方案)、价值预期FPU右边的方程,因此风和单位(mmol min-1mL-1),看起来像“国际单位/ mL”(廖/毫升)。

Ghose自己所指出的,然而,由于FPU化验是非线性的,使用国际单位本身是不正确的,因为这个单位是基于最初的速度,即线性反应产生的产品以相同的速度在每分每秒的反应。

”作者继续建议FPU价值观对于一个给定的纤维素酶解给出简单的结论称为“单位/ mL”。

“滤纸单位”的定义。

由于上述选择的数值,“滤纸单位”实际上不是明确的定义。

滤纸单位的定义是0.1875 FPU,即酶活动的数量,根据指令的结果,将会产生包含减少相当于2.0毫克的糖的葡萄糖。

一个能从等式验证了由计算假定的酶解不需要进行稀释来满足。

还原糖含量相当于2.0毫克的葡萄糖(例如,“酵素浓度”的比例分母等于1,在这种情况下,这个活动的解进行测量为0.37滤纸单元每毫升。

因为0.5毫升的这个方案被用于检测、绝对数量的酶活性的测定,从中可看出等作用能被0.1875 FPU)。

另一方面,我们有一个确定的方法测量了纤维素酶的活性0.1875含有滤纸单元每0.5毫升化验aliquot(0.37滤纸单位曼梯·里的酶解),但是我们没有办法测量酶解的滤纸活动和其他任何价值的解决方案。

含有超过0.37”单位”每毫升须因此被稀释到这个标准来衡量的价值,并含有少于0.37单位“每毫升”、还原糖产生于60分钟小于2.0毫克的等效葡萄糖)不能指定的“滤纸单位”的活动。

这些后者“sub-2.0-mg "要么必须集中在解决溶解之前,要么活动的化验报告不应该报道为“滤纸单位”,而是应报告为“mmoles葡萄糖平均每分钟释放量”。

Ghose(1987)解释的特殊情况下参与计量滤纸。

活动”,工人正在呼吁关注文本的文章(特别是文本围绕方程的263页),而不仅仅是“提升”的方程式本身。

13。

附录B:为例IUPAC-FPU计算
13.1纤维素酶活性测定酶制剂的使用方法,概述了在IUPAC基础上的方法。

在所有的酶稀释,柠檬酸钠缓冲4.8,下表所示的酶解正在被稀释的酶在柠檬酸中缓冲1:20。

术语“专注”是用来表示这个比例的原酶解存在于稀释加入了胰高糖素的混合物。

举个例子,一个1:10 1:20稀释的股票的工作将集中酶的0.005。

13.2葡萄糖稀释标准和做出稀释的标准曲线。

13.3葡萄糖浓度的测定标准曲线。

13.4测定酶的浓度,就会释放完全2.0毫克的葡萄糖,通过对酶浓度（enzyme dilution）的葡萄糖（glucose）中释放出来。

13.5从图中计算FPU vs.葡萄糖稀释浓度。

0.37/0.0053=70 FPU/mL。