纤维素酶活性测定

纤维素酶活性测定

技术报告NERL/TP-510-42628 2008年1月实验室程序分析发行日期：1996年8月12 日

B. 阿德尼和J. 贝克

科罗拉多州科尔大道戈尔登国家可再生能源实验室1617，80401-3393303-275-3000• 美国能源部办公室的能源效率和可再生能源由中西部研究所•巴特尔主持。合同号：DE - AC36 - 99 - GO10337

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纤维素酶活性测定

技术报告

1。简介

1.1下面的方法介绍了纤维素酶的活性测定过程采用国际纯粹化学与应用化学的指导方针。该过程已被设计用来测量在“过滤条件下纤维素酶的活性单位”（FPU）的原始酶液。对于酶制剂的定量结果进行比较，必须在此基础上进行重要的和平等的转换。

2.0毫克血糖的价值相当于从50毫克的过滤纸在60分钟（4％的转换）已被指定为计算所的IUPAC的滤纸纤维素酶单位（FPU）的拦截的还原糖。

1.2这是极为重要的一点，要记住：FPU的定义只是在这个意义上的转换。还原糖产量不是在检测的混合物中线性函数酶的数量，而是由高斯讨论（1987年），两倍的酶不会在相等的时间被预期得到两倍还原糖的产率。因此该检测程序需要找到一种稀释原始的酶原料，比如一个0.5毫升稀释液在60分钟内稀释催化4％（或者，在实践中，发现两个稀释支架上的4％转换点，使之密切合作，所需的稀释可以

得到合理的精度，有插值），然后计算符合稀释要求原活动（浮点运算单元/毫升）。进一步评价所需的计算，其重要意义，要在附录中找到。

1.3测定混合物时，可能在某些情况下含有还原糖与底物蔗糖水解酶。将发酵液的检测纤维素酶可能含有营养糖，纤维素和还原端基体聚合物的有时在任何酶的攻击下是可以衡量葡萄糖的量。出于这个原因，控制包括酶无需底物和酶的底物，不包括所有酶检测值与样品空白值的任何修正。

2。范围

2.1本程序只用于浮点运算单元，在一个适当的活性中，测定纤维素酶的制备过程的IUPAC定义如上所述。

3。参考文献

3.1高斯，T.K. 1987。“测量纤维素酶的活动。”纯净代谢。化学。59：257-268。3.2米勒，G.L.1959 “利用二硝基水杨酸试剂测定还原糖。”分析化学。31:426-428。

4。意义和使用

4.1这个步骤根据IUPAC（国际理论和应用化学联合会）理论，决定了在纤维素酶的准备工作中酶活动的滤纸功效。

5。装置设备

5.1保持在500C范围内的水浴。

5.2 能测量540nm吸光度的分光光度计。

6。试剂和反应物

6.1蒸馏水1416ml

二硝基水杨酸10.6g

氢氧化钠19.8g

混合溶解上述物质，然后添加罗谢尔盐306g

苯酚7.6ml（在500C时溶解）

焦亚硫酸钠8.3g

将3ml样品混合着0.1N盐酸滴到酚酞的末端，它将需要5-6ml盐酸，如果需要，添加氢氧化钠。

6.2柠檬酸盐缓冲溶液：对于里氏木霉纤维素酶，在PH值为4.8的0.05M柠檬酸盐缓冲溶液中执行纤维素酶鉴定。

对于其他纤维素酶，PH值和温度可能会不同。当报告结果时，鉴定的条件一定是明确的。

柠檬酰胺210g

去离子水750ml

添加氢氧化钠直至PH为4.3

在溶液中加水冲淡至1L，然后测其PH。如果需要，在溶液中加入氢氧化钠至PH值为4.5.当1M柠檬酸盐缓冲溶液用水冲淡至50mM，那么它的PH应该为4.8.在冲淡柠檬酸钠缓冲溶液至PH为4.8时，检测和适应它。

7。思考与尝试

7.1追随合适的特定的卫生计划方针的NREL实验室。

7.2 当使用有毒的，腐蚀的苯酚时，一定要小心。

8。使纤维素糖化的滤纸分析的步骤

8.1通过类似的和完全相同的三类试验方法发现的糖苷键分裂为下面讲述的细节作了准备。这种酶作用物是一种高级滤纸条

（1.0cm*6.0cm）。

8.2酶的试管化验

8.2.1在每个13*100的试管中放置一张卷的滤纸。

8.2.2 将1.0ml，PH为4.8的0.05M的柠檬酸钠加入试管中，缓冲溶液应该使滤纸饱和。

8.2.3 使令缓冲溶液的试管和酶作用物相互平衡，都达到50O C。8.2.4 在柠檬酸盐缓冲溶液中加入0.5ml稀释的酶，至少两种稀释溶液必须由酶样品制成，一种稀释溶液释放超过2m的葡萄糖，另外一种少于2mg。这两种稀释溶液把释放2.1和1.9mg葡萄糖作为目标，依赖于酶，这种目标实现比较困难，额外的稀释溶液必须使用。

8.2.5 在50O C环境下培养60min。

8.2.6 在培养最后阶段，将试管从50O C水浴中移出，通过和加入

3mlDNS试剂并与溶液混合使酶停止反应。

8.3试剂和反应物

8.3.1试剂溶液：1.5ml柠檬酸盐缓冲溶液。

8.3.2酶控制：1.0ml柠檬酸盐缓冲溶液+0.5ml稀释的酶（为每个稀释溶液准备一个独立的控制）。

8.3.3酶作用物控制:1.5ml柠檬酸盐缓冲溶液+滤纸条。

8.4葡萄糖标准