流式细胞术原理及应用 PPT
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《流式细胞术》课件
抗体标记
利用特异性抗体与细胞表面抗原结合，将荧光染料标记在细胞上。
细胞分选的原理
流体动力学
通过调整液流速度和压力，控制细胞通过喷嘴的速度 。
静电场
在流动室中施加静电场，使带电的荧光微球和细胞偏 转至收集管中。
声波振荡
利用声波振荡器产生振动，使细胞在流动室中分散并 均匀分布。
数据分析与解读
数据获取
荧光染料干扰
荧光染料可能会产生交叉干扰或淬灭现象， 影响实验结果的准确性。
技术展望与未来发展
1 新技术应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
2 人工智能辅助数据分析
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
收集流式细胞仪产生的荧光信号和散射光信号 数据。
数据处理
利用软件对数据进行处理，包括去背景、校正 和归一化等操作。
结果解读
根据数据分析结果，解读细胞的表型、功能和活性等信息。
03
实验操作流程
样品制备
样品来源
流式细胞术的样品主要来自各类组织、血液 、培养细胞等。
样品处理
样品需要经过一系列的处理，如离心、洗涤 、细胞分离等，以去除杂质并获得纯净的细 胞样品。
3 个性化医疗应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
4 拓展应用领域
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
感谢您的观看
利用特异性抗体与细胞表面抗原结合，将荧光染料标记在细胞上。
细胞分选的原理
流体动力学
通过调整液流速度和压力，控制细胞通过喷嘴的速度 。
静电场
在流动室中施加静电场，使带电的荧光微球和细胞偏 转至收集管中。
声波振荡
利用声波振荡器产生振动，使细胞在流动室中分散并 均匀分布。
数据分析与解读
数据获取
荧光染料干扰
荧光染料可能会产生交叉干扰或淬灭现象， 影响实验结果的准确性。
技术展望与未来发展
1 新技术应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
2 人工智能辅助数据分析
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
收集流式细胞仪产生的荧光信号和散射光信号 数据。
数据处理
利用软件对数据进行处理，包括去背景、校正 和归一化等操作。
结果解读
根据数据分析结果，解读细胞的表型、功能和活性等信息。
03
实验操作流程
样品制备
样品来源
流式细胞术的样品主要来自各类组织、血液 、培养细胞等。
样品处理
样品需要经过一系列的处理，如离心、洗涤 、细胞分离等，以去除杂质并获得纯净的细 胞样品。
3 个性化医疗应用
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
4 拓展应用领域
随着新技术的不断发展，如纳米技术、基因编辑等，流 式细胞术有望在检测灵敏度、特异性及多参数分析等方 面取得突破性进展。
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流式细胞仪原理及应用通用课件
血小板功能研究
利用流式细胞仪检测血小板表面的活化标志物，可以研究血小板在血 栓形成、止血等过程中的功能变化。
生物学研究
细胞周期分析
流式细胞仪可以通过检测细胞内DNA含量变化，分析细胞的周期 分布，研究细胞增殖和凋亡过程。
细胞表面标志物分析
利用流式细胞仪可以检测细胞表面的各类标志物，研究细胞的分化 、成熟和功能。
将处理好的样品加载到流式细胞仪中，注 意加载量应适中，避免过多或过少影响实 验结果。
实验操作
安全注意事项
根据实验需求设置流式细胞仪的参数，如 荧光染料激发波长、检测灵敏度等，并启 动实验程序进行实验。
在实验过程中，需要注意安全，如佩戴防 护眼镜、避免接触有毒有害试剂等。
数据处理与分析
数据收集
实验结束后，将实验结果数据进 行收集，通常数据包括细胞荧光
在白血病治疗过程中，流式细胞仪 可以检测患者体内微小残留病灶的 数量和变化，帮助评估治疗效果和 预后。
免疫治疗方案指导
白血病的免疫分型结果可以为免疫 治疗方案的选择提供参考，帮助制 定个体化的治疗方案。
淋巴瘤诊断与分型
淋巴瘤细胞表型分析
01
流式细胞仪可以检测淋巴瘤细胞表面的免疫表型标记，帮助诊
断和分型不同类型的淋巴瘤。
流式细胞仪原理及 应用通用课件
目录
• 流式细胞仪概述 • 流式细胞仪在生物医学研究中的应用 • 流式细胞仪在临床医学诊断与治疗中的应
用 • 流式细胞仪实验操作与数据分析
01
流式细胞仪概述
定义与发展历史
定义
流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速 检测细胞特性的技术，可实现对单个细胞的多参数、高通量 分析。
利用流式细胞仪检测血小板表面的活化标志物，可以研究血小板在血 栓形成、止血等过程中的功能变化。
生物学研究
细胞周期分析
流式细胞仪可以通过检测细胞内DNA含量变化，分析细胞的周期 分布，研究细胞增殖和凋亡过程。
细胞表面标志物分析
利用流式细胞仪可以检测细胞表面的各类标志物，研究细胞的分化 、成熟和功能。
将处理好的样品加载到流式细胞仪中，注 意加载量应适中，避免过多或过少影响实 验结果。
实验操作
安全注意事项
根据实验需求设置流式细胞仪的参数，如 荧光染料激发波长、检测灵敏度等，并启 动实验程序进行实验。
在实验过程中，需要注意安全，如佩戴防 护眼镜、避免接触有毒有害试剂等。
数据处理与分析
数据收集
实验结束后，将实验结果数据进 行收集，通常数据包括细胞荧光
在白血病治疗过程中，流式细胞仪 可以检测患者体内微小残留病灶的 数量和变化，帮助评估治疗效果和 预后。
免疫治疗方案指导
白血病的免疫分型结果可以为免疫 治疗方案的选择提供参考，帮助制 定个体化的治疗方案。
淋巴瘤诊断与分型
淋巴瘤细胞表型分析
01
流式细胞仪可以检测淋巴瘤细胞表面的免疫表型标记，帮助诊
断和分型不同类型的淋巴瘤。
流式细胞仪原理及 应用通用课件
目录
• 流式细胞仪概述 • 流式细胞仪在生物医学研究中的应用 • 流式细胞仪在临床医学诊断与治疗中的应
用 • 流式细胞仪实验操作与数据分析
01
流式细胞仪概述
定义与发展历史
定义
流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速 检测细胞特性的技术，可实现对单个细胞的多参数、高通量 分析。
《流式细胞术贝克曼》课件
贝克曼流式细胞仪的应用
免疫学研究
贝克曼流式细胞仪在免疫学研究 中广泛应用，可以用于检测免疫 细胞的表面标志物、功能活性以
及免疫细胞的分选和培养等。
血液学研究
贝克曼流式细胞仪可以用于血液 学研究，检测血细胞的表面标志 物、血型抗原等，以及进行血细
胞的分选和培养等。
肿瘤研究
贝克曼流式细胞仪可以用于肿瘤 研究，检测肿瘤细胞的表面标志 物、肿瘤抗原等，以及进行肿瘤
辐射安全
废弃物处理
正确操作仪器，避免对实验人员造成辐射 伤害。
按照规定处理实验废弃物，确保实验室环 境的安全和环保。
贝克曼流式细胞仪的特点
高通量
贝克曼流式细胞仪具有高通量的 特点，能够在短时间内处理大量 细胞样本，提高了实验效率和检
测速度。
高灵敏度
贝克曼流式细胞仪采用先进的光电 检测技术，能够检测到微弱的荧光 信号，具有高灵敏度，能够检测到 低浓度的细胞标记物。
多参数分析
贝克曼流式细胞仪可以同时检测多 个参数，包括细胞大小、颗粒性、 荧光信号等，从而对细胞进行多维 度的分析和分选。
贝克曼流式细胞仪的原理
流式细胞术原理
流式细胞术是一种在液流中快速检测和分选细胞的技术。通 过将单个细胞与荧光染料结合，利用激光束激发荧光，并通 过光电倍增管检测荧光信号，实现对细胞的快速分析和分选 。
贝克曼流式细胞仪的原理
贝克曼流式细胞仪是应用流式细胞术的仪器之一，其原理是 将待测细胞与荧光染料结合后，通过高压液流将细胞送入流 动室，在流动室内与激光束相遇，激发荧光信号，并通过光 电倍增管进行检测和记录。
用于检测精子细胞和卵 子细胞的活性与质量。
流式细胞术的发展历程
20世纪70年代
流式细胞术原理及应用通用课件
抗菌药物敏感性测试
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03
04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。
通过流式细胞术可以检测细菌对抗菌药物的敏感性，为临床合理用 药提供科学依据。
05 流式细胞术的数 据分析与解读
数据文件类型与读取方式
FCS文件
流式细胞术数据文件常用FCS格式，可以使用专业软件（如FlowJo、Cytobank 等）或编程语言（如R、Python等）读取和处理。
快速检测。
多参数分析：可同时检测细胞 的多个参数，如大小、形态、
内部结构、表面抗原等。
灵活性：可根据研究需求灵活 调整检测参数和实验方案。
流式细胞术的应用范围
01
02
03
04
05
基础医学研究
临床医学诊断
用于细胞生物学、免疫学、 辅助临床疾病的诊断、病
遗传学等领域的基础研究， 情评估和疗效观察，如白
历史发展
起源：流式细胞术起源于20世纪60年代，当时为了满足生物医学研 究中对细胞快速、准确分析的需求。
技术发展：随着激光技术、计算机科学和生物学的不断进步，流式细 胞术逐渐发展成为一项高精度、高通量的细胞分析技术。
技术原理与特点
技术原理
液态样本流动：将细胞悬浮于液体中，形成细胞悬液，通过微管道连续流动。
数据读取方式
数据读取方式分为文件导入和实时获取两种。文件导入方式是将存储在硬盘中的 FCS文件导入到分析软件中，而实时获取方式则是通过流式细胞仪与电脑连接， 直接将数据获取到分析软件中。
数据预处理与质量控制
数据清洗
去除噪声、杂质和不必要的信号，以减少分析时的干扰和误差。
补偿调 整
对于多色荧光染色，需要进行荧光补偿调整，以消除荧光染料间的 交叉干扰。
多模态流式细胞术
多模态流式细胞术允许在单个平台上整合多种检测技术，如荧光共振能量转移 （FRET）、质量细胞术等，从而提供更丰富的细胞信息。
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞术原理及临床应用-PPT文档
FCM检测白血病微小残留病变(MRD):
MRD 是 白 血 病 复 发 的 主 要 根 源 ， FCM 的 高 特 异性和敏感性可以在患者缓解期检测是否有残 留病变细胞，早期探测MRD，以免复发
FCM在临床肿瘤学中的应用
1.血液标本的检查 ● 肿瘤患者的免疫功能检查 ● 肿瘤患者的粘附分子检查：在肿瘤的浸润与转
细胞凋亡的生物学意义
胚胎形成、肌体正常发 育、衰老和损伤细胞的清 除以及肿瘤的发生、发展 和转归等都与细胞凋亡有 关。
生物医学的研究热点
FCM在血栓性疾与止血中应用
由于活化血小板是血栓的主要
成分之一，血小板活化程度的增 高与疾病的发生发展有关。 利用 流式细胞仪可检测血小板活化指 标，了解血小板状态和活化进程 。 巨血小板 血小板无力症 网织血 小板
肿瘤细胞耐药性
MDR是由多药耐药基因编码的P糖蛋白（P-gp） 亲脂化合物，包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性 排出泵。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时，患者对 化疗药物开始出现耐
细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序 的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调 控等的作用；是为更好地适应生存环境而主动争 取的一种死亡过程。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或 生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表 现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核 变化较慢，DNA 降解不充分，引起局部严重的 炎症反应
可用流式细胞仪分析的标本
外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、各种体液 （尿、脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等）
单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞 粒子、可溶性分子
流式细胞仪的基本功能
•细胞表型分析：包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析 •DNA含量及细胞周期分析、细胞凋亡检测 •目标细胞分选 •自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测 •流式蛋白定量技术：血浆中各种细胞因子的含量
流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
ppt课件
10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
ppt课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
ppt课件
15
细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
ppt课件
21
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
流式细胞术简介及应用进展ppt课件
CBA反响微球探针复合体构造方式 图
(如可溶性血清蛋白分子的CBA 检测〕
;
Thanks for your attention!
;
;
三、流式细胞术运用的新进展
;
高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s 高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； 高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%；
高精度：CV值：7% →< 1%; 多参数：荧光：1个 →12个参数； 高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; 其 它：荧光信号：线性检测→对数检测 光谱重叠：补偿修饰剔除联体细胞及碎片
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司〕
;
BD FACSCalibur型 FCM 〔单L，3F〕
;
Coulter EPICS XL/XL-MCL 〔单L，4F〕
;
BD FACSVantage SE 〔14F， four-way sorting〕
;
1、 Quantitative FCM (QFCM)
定量流式细胞术〔Quantitative FCM, QFCM〕 是用流式细胞仪对特定细胞外表抗原进展绝对 定量。其根本原理是采用某种规范物质获得一 条规范曲线或线性方程，然后获得待测抗原绝 对分子数。
;
2、cytometric bead array (CBA)
FCM是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流膂力学、激光技术、高等 数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等到学科知识综 合运用的结晶。
现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量 荧光细胞化学的运用，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研讨 领域的运用有了更加突飞猛进的开展
(如可溶性血清蛋白分子的CBA 检测〕
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Thanks for your attention!
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三、流式细胞术运用的新进展
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高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s 高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； 高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%；
高精度：CV值：7% →< 1%; 多参数：荧光：1个 →12个参数； 高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; 其 它：荧光信号：线性检测→对数检测 光谱重叠：补偿修饰剔除联体细胞及碎片
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司〕
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BD FACSCalibur型 FCM 〔单L，3F〕
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Coulter EPICS XL/XL-MCL 〔单L，4F〕
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BD FACSVantage SE 〔14F， four-way sorting〕
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1、 Quantitative FCM (QFCM)
定量流式细胞术〔Quantitative FCM, QFCM〕 是用流式细胞仪对特定细胞外表抗原进展绝对 定量。其根本原理是采用某种规范物质获得一 条规范曲线或线性方程，然后获得待测抗原绝 对分子数。
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2、cytometric bead array (CBA)
FCM是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流膂力学、激光技术、高等 数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等到学科知识综 合运用的结晶。
现代流式细胞术，更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定量 荧光细胞化学的运用，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研讨 领域的运用有了更加突飞猛进的开展
流式细胞术的基本原理及其应用ppt课件
4
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞仪基本结构 流动室与液流系统
光源与光学系统 信号收集与信号转换系统
计算机与分析系统
分选系统
5
流式细胞仪的液流系统
6
流式细胞仪的光学系统
光电转换器件
流动室
检测点Biblioteka 激光器7流式细胞仪的光信号
1. 散色光信号
前向角散色（Forward Scatter，FSC）
小角散色，与细胞直径成近似直线关系。
荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm
颜色
FITC
488
525
绿色
PE
488
575
橙黄色
PerCP
488
677
深红色
APC
633
660
红色
11
12
四种激光器 355nm 405nm 488nm 633nm
可进行多达10色以 上的多色荧光分析
BD LSR Ⅱ
13
流式细胞术的应用
❖ 细胞表面分子 ❖ 细胞内或细胞核内抗原 ❖ 细胞凋亡 ❖ DNA含量检测与细胞周期的分析 ❖ 细胞增殖 ❖ 细胞毒的检测与分析 ❖ 可溶性蛋白分子 ❖ 报告基因 ❖ 其它
流式细胞术基本原理及应用
漆冬梅
1
❖流式细胞仪（flow cytometer）
是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的新型高科技仪器。
大型机、科研型
台式机、临床型
2
目前最新型流式仪
3
❖流式细胞术（flow cytometry）
利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分 析或分选的技术。
流式细胞术的原理及应用ppt课件
➢可把感兴趣细胞分 选到特定培养孔或板 上（4路和24孔板）
➢适用于高速分选和 多色分析
6
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
18
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
10
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
5
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
➢适用于高速分选和 多色分析
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细胞粒度
细 细胞表面面积
胞 结
核浆比例
构 DNA含量与细胞周期
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
散射光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同 类型的细胞群加以区分
FSC（小角散射光)它反 应细胞的相对大小和截 面积的大小
SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化
1.液流系统： 细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液
(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细 胞悬液。
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
2.光学系统： 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： ➢多数字化 ➢适用于各类细胞分选 ➢4路分选
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在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
FACSAria
科研型
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和类 型激光器
成,将产生的光信号引导至检测器
流式细胞术原理及应用63页PPT
流式细胞术原理及应用
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— Байду номын сангаас鹤琴
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— Байду номын сангаас鹤琴
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
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CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE
SSC SSC Foxp3 PE
FSC
CD4 FITC
CD25 APC
C、选择光谱重叠小的染料
• 尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7； • 选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC，PE/APC；
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大 ，多使用对数放大。
•线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白 含量 •对数测量：细胞膜表面抗原检测
直方图（Distribution Histogram） 散点图（Dot Plot）
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
• FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值 。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 荧光染料/荧光化合物 ✓ PI、7-AAD等插入核酸链中； ✓ CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
常用荧光素
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
5% 默认阈值
Hale Waihona Puke 32% 升高阈值后荧光信号 •细胞自发荧光 •特异荧光素标记激发的荧光信号 •荧光信号的线性测量和对数测量---光电倍增管
1）检测光子，转换成电信号 2）将电信号等比例的放大 •荧光信号的面积、宽度和高度
• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信 号的放大可以使用线性或对数两种方式。
• 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量 分析。
流式细胞仪构造图
流式细胞仪五大系统
• 流动室与液流驱动系统 • 激光光源及光束成形系统 • 光学系统 • 信号检测与分析系统 • 细胞分选系统
流动室与液流驱动系统
1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样
流动室，430×180um,鞘液
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
B、根据抗原表达强弱合理分配荧光素
• 荧光素的强度： ✓染色指数 Stain Index
Stain Index = D/W
CD4
• 高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表 达低的抗原：
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
细胞分选系统
• 电荷式分选 ✓超声振动器(15-100kHz) ✓液流充电系统 ✓高压偏转板 ✓收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
二、荧光素
•荧光的概念：
＜
激发波长 Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
• 荧光素（FITC/PE/PerCP/APC等) ✓ 抗体偶联荧光素； ✓分子探针结合荧光素Annexin V-FITC；
流式细胞术原理及应用
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
• 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合 成微球等。
Injector Tip Sheath
fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
激光光源与光束成形系统
1.氩离子气体激光器，22×66um 2.固体激光器 405nm, 488nm,561nm,635nm
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
实验步骤： •细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
9
光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
• 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的 A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定 量染料。
SSC SSC Foxp3 PE
FSC
CD4 FITC
CD25 APC
C、选择光谱重叠小的染料
• 尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7； • 选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC，PE/APC；
• 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大 ，多使用对数放大。
•线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白 含量 •对数测量：细胞膜表面抗原检测
直方图（Distribution Histogram） 散点图（Dot Plot）
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
• FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值 。
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式 与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量 分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 荧光染料/荧光化合物 ✓ PI、7-AAD等插入核酸链中； ✓ CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
常用荧光素
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
5% 默认阈值
Hale Waihona Puke 32% 升高阈值后荧光信号 •细胞自发荧光 •特异荧光素标记激发的荧光信号 •荧光信号的线性测量和对数测量---光电倍增管
1）检测光子，转换成电信号 2）将电信号等比例的放大 •荧光信号的面积、宽度和高度
• 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信 号的放大可以使用线性或对数两种方式。
• 对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量 分析。
流式细胞仪构造图
流式细胞仪五大系统
• 流动室与液流驱动系统 • 激光光源及光束成形系统 • 光学系统 • 信号检测与分析系统 • 细胞分选系统
流动室与液流驱动系统
1.空气加压进样 2.蠕动泵精确定量进样
流动室，430×180um,鞘液
荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
B、根据抗原表达强弱合理分配荧光素
• 荧光素的强度： ✓染色指数 Stain Index
Stain Index = D/W
CD4
• 高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表 达低的抗原：
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
细胞分选系统
• 电荷式分选 ✓超声振动器(15-100kHz) ✓液流充电系统 ✓高压偏转板 ✓收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
二、荧光素
•荧光的概念：
＜
激发波长 Excitation wavelength
发射波长(荧光波长) Emission wavelength
•激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 •发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光
• 荧光素（FITC/PE/PerCP/APC等) ✓ 抗体偶联荧光素； ✓分子探针结合荧光素Annexin V-FITC；
流式细胞术原理及应用
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
• 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合 成微球等。
Injector Tip Sheath
fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
激光光源与光束成形系统
1.氩离子气体激光器，22×66um 2.固体激光器 405nm, 488nm,561nm,635nm
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
实验步骤： •细胞处理（全血，培养的细胞） •染色（室温，20min） •离心洗涤（全血裂红） •上机检测
1)荧光素的选择：
• A、根据机器配置选择荧光素 • 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的
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光学系统
透镜、滤光片、小孔； LP：long-pass filter BP：band-pass filter
460 500 540
SP：short-pass filter
LP 500
SP 500
BP500/50
信号检测与分析系统
物理参数 •FSC：前向角散色光， 代表细胞大小 •SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度
• 7-AAD（7-氨基放线菌素D 545, 647 ） 以插入的方式与DNA链的G-C碱基 对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
• DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456） 可以非嵌入方式与DNA链上的 A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定 量染料。