生物工程综合实验

土壤微生物蛋白酶的筛选与提取总结报告

摘要：土壤是微生物生长的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，我们可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。本实验采用平板分离法从土壤混杂的微生物群体中筛选出产蛋白酶的菌种。大体初筛、复筛、测试发酵条件、小型发酵罐发酵，最终对发酵液进行蛋白酶提取。经过初筛和复筛，从土壤中得到一个碱性蛋白酶高产菌株，作为目的菌株，其酶活为 1.608U/ml，并用于发酵产生蛋白酶。在微生物发酵过程中，培养基、温度、PH等多种因子对发酵有较大的影响，并且还会产生交互作用，需要通过试验了解这多个因子的联合效应。用正交法，利用正交表来安排与分析多因素试验，通过不同的水平组合培养菌种，最终找出最优组合，按比例放大用于发酵罐发酵。发酵完成后，取发酵液，可直接用盐析离心的方法得到蛋白酶。

关键词：分离纯化菌种筛选正交法培养发酵盐析冷冻离心

1.产蛋白酶菌种的初筛

1.1实验材料

样品：土壤样品

培养基：酪素培养基（配方：葡萄糖0.5g NaCl 5g K2HPO4 0.5g KH2PO4 0.5g 酪素10g 蒸馏水1000ml 琼脂20g pH 7.5）

试剂：1mol/L HCl 1mol/L NaOH 2.5%三氯乙酸

仪器用具：高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，天平，无菌玻璃涂棒，量筒，移液管，三角瓶，试管，玻璃棒，培养皿，玻璃珠

1.2实验方法

1.2.1培养基制备

通过称量，溶解，调节pH等步骤，配制酪素培养基，并配制90 ml无菌水（内装几颗玻璃珠）1瓶，4.5 ml无菌水若干支，0.1MPa灭菌30min后备用；另包扎好培养皿，移液管，玻璃涂棒，枪头等，灭菌，烘干备用

1.2.2倒平板

将灭过菌的酪素培养基加热融化待冷至55-60℃，以无菌操作法倒至经灭菌并烘干

的培养皿中，每皿约 20ml，冷却凝固待用

1.2.3制备土壤稀释液

称取土样10g，放入盛90 ml无菌水并带玻璃珠的三角瓶中，振摇约20 min，使土

样与水充分混合，将细胞分散，即为 10-1的土壤稀释液

取4.5 ml无菌水4支，用记号笔编上10-2，10-3，10-4，10-5。用无菌移液管从中吸取0.5ml10-1的土壤悬液加入盛有4.5 ml无菌水的试管中，充分混匀配成10-2稀释

度的土壤溶液，然后依次吸取0.5 ml加入别的试管中分别配成10-3，10-4，10-5不同稀释度的土壤溶液

1.2.4涂布

将上述平板分别用记号笔写上10-3，10-4，10-5，每个稀释度标三个平板，然后用无菌移液管分别由10-3，10-4，10-5的土壤稀释液中各吸取100ul对号放入已写好稀释

度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，室温下静止5-10min，使菌液吸附进培养基

1.2.5 培养

将涂布好的平板倒置在恒温培养箱中28℃培养2-3天。培养后在平板上滴加2.5%三氯乙酸溶液，以刚铺满平板为度。菌落周围如有无色透明圈出现，说明该菌产生蛋白酶。若杂菌干扰不严重，可适当延长平板的培养时间，以便挑取生长速度较慢的菌株

1.3 实验结果

这次实验在我们配制酵素培养基时颜色就比较深，与其他组均有明显区别，有可能是

我们组的PH

调高了一点，使得酵素充分溶解，通过这不同稀释度的培养基也能看到长有透明切明亮透明圈的菌落。 1.4 思考题

1.4.1 除涂布法外，你还知道那些分离方法？比较各种分离方法的优缺点？

答：应该还有平板画线法；稀释倒平板法和搁斜面法。

稀释混合平板法： 优点：可以计数，吸收量为1ml ，较方便。 优点：不能观察菌落特征。 一般用于菌落总数的计数。

平板划线法： 优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离。 缺点：不能计数 一般用于从菌种的分纯。

涂布法使用较多，但有时不均匀，稀释倒平板法操作相对麻烦，不适合好氧和对热敏感的细菌培养 ，应用范围：涂布法适用于好氧菌，稀释倒平板法适用于厌氧，兼性厌氧。

1.4.2 菌株的选育为什么要分初筛与复筛？

分布进行可以减少实验量，同时能够更好更高效的对目的菌株进行分离。

1.4.3 查找资料，根据所在地的特殊生态环境（如盐湖，温泉，酸性土壤等），设计一个筛

选方案来筛选这些生境中的特有微生物。

答：从盐湖筛选嗜盐菌

从自然界微生物中筛选某菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性

能测定。

（1）培养嗜盐菌的菌样应从盐湖采集。

（2）富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对嗜盐菌微生物的富集培

养应选择特定的酪素培养基，并在充分含盐条件下培养。

（3）接种前要对培养基进行高压蒸汽灭菌处理。在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在灭菌条件下进行。

（4）按不同稀释度涂板。接着对培养基进行平板划线。

（5）将涂布好的平板倒置在恒温培养箱中28℃培养2天。若长出菌落则是嗜盐菌菌落。

2.产蛋白酶菌种的复筛

2.1实验材料

从1中初筛得到的两个菌株

2.2实验方法

2.2.1菌液准备

配制葡萄糖蛋白胨水培养基400mL分装于4个250mL三角瓶，0.1Ma灭菌20分钟。

将2个菌株用接种环接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，每个菌株接种2瓶

2.2.2菌种保存

配制牛肉膏蛋白胨固体培养基30mL，分装于4支试管，盖上试管帽，灭菌，作4支斜面。用接种环接种2个菌株，每个菌株2支斜面保存

2.2.3培养

菌液放于37℃、摇床（140转/分）培养18—20h，斜面菌种放于37℃恒温培养箱培养

2.2.4菌体密度测定

菌液培养18—20h后，用无菌移液枪头取1mL 菌液于无菌试管中，用无菌水稀释2-3倍，在600nm下测定吸光度

2.2.5菌液酶活测定

菌液培养18—20h后，用无菌移液枪头取6ml 菌液于10 ml离心管中，严格配平，4℃、6000转/分离心10分钟，取上清液测定菌株胞外蛋白酶活性

2.2.5.1样品管处理：

吸取0.5%酪蛋白溶液2 mL置于试管中，在40℃水浴中预热5分钟后加入同样条件

下预热好的菌液上清液1 mL，立即计时。反应10分钟后，由水浴取出，并立即加

入10%三氯乙酸溶液3 mL，室温下放置15分钟后，4℃、6000转/分离心10分钟2.2.5.2对照管处理：

同时另作一对照管，即取酶液（即菌液上清液）1 mL，，先加入3 mL10%的三氯乙酸溶液，然后再加入0.5%的酪蛋白溶液2 mL，40℃水浴中保温10分钟，室温放置15分钟，4℃、6000转/分离心10分钟

2.2.5.3显色

取3支试管，编号。分别加入样品处理及对照处理上清液和水各1 mL，然后各加入

0.55mol/L的碳酸钠溶液5 mL，混匀，立即加入Folin试剂1 mL，立即混匀，40℃

水浴中显色15分钟

2.2.5.4吸光度测定