高效液相色谱法资料.

Data station (Recorder)
液相色谱流程 图 PUMP
Mobile phase
Column Detector
W
Data station
(Recorder)
or Collection
HPLC与GC差别 ✓ 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测
✓ 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行
泵内。
2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。
3.高压泵：
➢ 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
➢ 输液泵种类：恒压型和恒流型。
➢ 恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于 柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推 动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统 阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已 较少使用。
性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 ➢ 流动相种类较多，选择余地广 ➢ 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
3．操作条件差别
❖ GC：加温操作
❖ HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
➢ 四类基本类型色谱法
空间排阻色谱法（SEC），固定相为化学惰性多
孔物质——凝胶，凝胶具有一定大小的孔穴，体积大 的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出 来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入 内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本按其分子 大小先后排பைடு நூலகம்，从柱中流出。
正相色谱（反相色谱）
➢ 正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作 流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
储液器
高压泵
梯度洗 提装置
压力表
进样器
色
谱 记录仪
柱
馏分收集器
检测器
一 高压输液系统
1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni
➢ 四类基本类型色谱法
吸附色谱法（adsorption chromatography）， 基于在溶质和用作固定相吸附剂上的固定活性 位点之间的相互作用。
➢ 四类基本类型色谱法
离子交换色谱法（IEC），固定相是一些带电荷的基团，
这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果 流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些 离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电 荷的时候，其可交换离子为阴离子。这种离子交换剂为阴离子交 换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来与流动相交换的离子 就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。
高效液相色谱法（ high performance liquid chromatography；HPLC）是在经典液相色 谱法的基础上，引入了气相色谱的理论与高 压技术，以高压输送流动相，采用高效固定 相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相 色谱分离分析方法。
概述 • 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 • 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1-5cm, 长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固
➢ 高柱效——远高于一般LC ➢ 高灵敏度 ➢ 高选择性 ➢ 分析速度快 ➢ 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
➢ 四类基本类型色谱法
分配色谱法（partition chromatography）， 利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解 度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段 分布于色谱柱或者担体表面。
1．分析对象 ➢ GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品
高沸点、挥发性差、热稳定性差、 离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20% ➢ HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
2．流动相差别 ❖ GC：流动相为惰性气体 ➢ 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 ❖ HPLC：流动相为液体 ➢ 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择
定相颗粒直径多在150-200m范围内。即使这样，流速仍然很
低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但
柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增
加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相
HPLC
分离和分析
柱内径2～6mm，固定相 粒径<10μm（球形，匀浆 装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑）
可以在线检测 分析时间大大缩短
气相色谱流程图
Flow or pressure controller
Column
Detector
Injection port
W
or valve
Carrier gas
以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱 效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。
HPLC与经典LC区别
HPLC与经典LC区别 ✓ 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
经典LC
仅做为一种分离手段 柱内径1～3cm，固定相 粒径>100μm 且不均匀
常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 无法在线检测 分析周期长
➢ 恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关， 使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。 应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每 分钟往复25～100次，因此脉动小。对流量变 化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连 接一脉动阻尼器)。
4.梯度淋洗装置
➢ 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种 以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变 它们之间的比例，从而使流动相的强度、 极性、pH值或离子强度相应地变化，达到 提高分离效果，缩短分析时间的目的。