钙调神经磷酸酶催化结构域的活性和性质

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钙调神经磷酸酶催化结构域的活性和性质

杨淑杰

魏

群(

382

1 材料与方法

(

,

Nde

µ°

°×µçÓ¾ÒÇΪ Bio-Rad 公司产品. 抗 CNA 和催化结构域多肽的多克隆抗体为本实验室制备的

[13]. DNA 测序按照双脱氧链终止法进行.

(

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blotting 印迹检测, 用本室制备的抗CNA 的多克隆抗体检测CNA 和催化结构域多肽, 两者都可被识别, 证明催化结构域多肽是CNA 的突变体.

2.2 催化结构域多肽和CNA 磷酸酶活力比较

用Mn 2+做激活剂, 按材料和方法进行磷酸酶活力分析. 分别测定在下列4种情况下的CNA 及CNA 催化结构域多肽的磷酸酶活力

: 加

CaM;

加CaM 和CNB. CNA 的磷酸酶活力是依次增加的, 而CNA 催化结构域多肽的比活力基本保持不变(图2). 两者相比, 在有CaM 和CNB 时, CNA 催化结构域多肽的活力为CNA 的20倍.

2.3 金属离子对磷酸酶活性的调节

(

无EGTA 和Ca 2+

;

2 mmol/L

Ca 2+. 结果为4种情况下酶活基本不变, 则说

明CNA 催化结构域多肽不依赖 Ca 2+的调节

(图3). 但Mg 2+在pH=8.5时仍为其强激活剂.

(

384

随温度和pH 值升高, 两者酶活性先增高, 随

后降低. CNA 的最适反应温度为

50

(图

5(a)). CNA 的最适反应pH 为7.0, CNA 催化

结构域多肽的最适反应pH 为8.0(图5(b)).

3 讨论

通过分子生物学手段, 我们对CNA 催化

结构域的cDNA

进行了克隆

385明CNA 催化结构域多肽已不再受CaM 和CNB 亚基的调节, 这与事实是相符的. 因为此时已将B 亚基结合区和CaM 结合区除去, 也就不能再受这两个蛋白的作用.

为进一步验证CNA 催化结构域多肽不再受Ca 2+的影响, 我们进行了CNA 催化结构域多肽分别含Ca 2+和EGTA 研究. 结果表明, 在pH=8.5, 6 mmol/L MgCl 2存在下CNA 催化结构域多肽在含Ca 2+, 不含Ca 2+和EGTA 3种情况下的酶活是相同的.

CNA 催化结构域多肽的Mn 2+激活曲线表明, 和CNA 亚基一致, 它仍保持着Mn 2+对它的强激活作用. 虽然它的激活活性比CNA 亚基要高几十倍, 但其受Mn 2+的激活强度仍随Mn 2+浓度的增加而增加. 实验(2.3(