04 实验四 抗药性突变株的分离

本实验采用梯度平板法分离大肠杆 菌的抗链霉素突变株。 菌的抗链霉素突变株。
梯度平板法(抗性突变株的筛选) 梯度平板法(抗性突变株的筛选)
Hale Waihona Puke Baidu
Ⅱ 上层含药品
Ⅰ底层不含药品
Ⅲ 生长情况
三、材料方法
1、菌株 大肠杆菌：Strs 大肠杆菌： 2、培养基 LB固体培养基（底层和上层） LB固体培养基（底层和上层） 固体培养基 3、溶液或试剂 链霉素（100mg/mL） 链霉素（100mg/mL） 4、仪器或其他用具 1ml无菌吸管，盛有 1ml无菌吸管 无菌吸管， 70%乙醇的烧杯 玻璃涂棒， 70%乙醇的烧杯，玻璃涂棒，水浴锅等 乙醇的烧杯，
在含有一定抑制生长药物浓度的平 板上涂布大量的细胞群体， 板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性 突变体就会在平板上长成菌落。经过挑 突变体就会在平板上长成菌落。 取纯化，进一步进行抗性试验就可以得 取纯化， 到所需要的抗药性菌株。 到所需要的抗药性菌株。
为了便于选择适当的药物浓度，分 为了便于选择适当的药物浓度， 离抗药性突变株常用梯度平板法。 离抗药性突变株常用梯度平板法。
实验四 抗药性突变株的分离
一、目的要求 二、基本原理 三、材料方法 四、操作步骤 五、实验报告
一、目的要求
1、学习用梯度平板法分离抗药性突变株。 学习用梯度平板法分离抗药性突变株。 2、了解基因突变的特点。 了解基因突变的特点。 3、了解诱变育种的原则和一般步骤。 了解诱变育种的原则和一般步骤。
二、基本原理
基因中碱基顺序的改变可以导致微生物 细胞的遗传变异。 细胞的遗传变异。 微生物的抗药性突变是DNA分子的某一 微生物的抗药性突变是DNA分子的某一 特定位置的结构改变所致，与药物的存在 特定位置的结构改变所致， 无关，某种药物的存在只是作为分离某种 无关， 抗药性菌株的一种手段， 抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发 突变的诱导物。 突变的诱导物。
四、操作步骤
1、接种大肠杆菌于 盛有5ml LB液体培养基的试 盛有5ml LB液体培养基的试 管中，37℃振荡培养24h。 24h。 管中，37℃振荡培养24h 2、在热水浴中溶化LB琼脂培养基。 在热水浴中溶化LB琼脂培养基。 LB琼脂培养基 3、倒10ml 已溶化的不含药物的LB琼脂培养基于 已溶化的不含药物的LB LB琼脂培养基于 一套无菌培养皿中，立即将培养皿一端垫起， 一套无菌培养皿中，立即将培养皿一端垫起， 使琼脂培养基覆盖整个底部并使培养基表面在 垫起的一端刚好达到培养皿的底与边的交界处， 垫起的一端刚好达到培养皿的底与边的交界处， 让培养基在这一倾斜的位置凝固。（图Ⅰ） 让培养基在这一倾斜的位置凝固。（图 。（
4、在已经凝固的平板低琼脂一边标示 “100”，放回水平位置后，再在底层培养 100”，放回水平位置后， 基上加入含有100ug/ml链霉素 LB琼脂 基上加入含有100ug/ml链霉素的LB琼脂 链霉素的 培养基10ml。凝固后， 培养基10ml。凝固后，便制得一个链霉素 浓度从一端的0ug/ml到另一端 浓度从一端的0ug/ml到另一端100ug/ml的 到另一端100ug/ml的 梯度平板。 梯度平板。 5、用1ml无菌吸管吸取200ul 大肠杆菌培养 1ml无菌吸管吸取 无菌吸管吸取200ul 液加到梯度平板上，涂布。 液加到梯度平板上，涂布。
6、37℃倒置培养48h。 37℃倒置培养48h。 7、选择1~2个在梯度平板中部的单个菌落， 选择1~2个在梯度平板中部的单个菌落 个在梯度平板中部的单个菌落， 用无菌接种环接触单个菌落朝高浓度区 域划线。 域划线。 8、把平板37℃倒置培养48h。 把平板37℃倒置培养48h。
五、实验报告
1、图示经一次培养和经二次培养的梯度平板上 大肠杆菌的生长情况。 大肠杆菌的生长情况。 2、试验中第7步，是为了测试这些菌株的抗性水 试验中第7 平，你能设计几种不同的方法来测试这些菌株 的抗性水平吗？ 的抗性水平吗？ 3、培养基中的链霉素引起了抗药突变吗？请设 培养基中的链霉素引起了抗药突变吗？ 计一个实验加以说明。 计一个实验加以说明。 4、梯度平板法除用于分离抗药突变株以外，还 梯度平板法除用于分离抗药突变株以外， 有什么其他用途？ 有什么其他用途？