木瓜蛋白酶的提取纯化实验报告

木瓜蛋白酶的分离纯化

一、目的

（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。

（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。

二、原理

木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量约为 23000 左右。在 25 ℃ , 时， 1 分钟生成1umol酪氨酸的酶量为 1 单位。木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。

酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。

三、实验材料

番木瓜汁；PEG (聚乙二醇，分子量为6000)； (NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考马斯亮蓝

四、仪器设备

（ 1 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式）

（ 2 ） 752 紫外分光光度计

（ 3 ）水浴箱

（ 4 ）冰箱

（ 5 ）榨汁机

五、玻璃器皿（以组为单位）

试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器

5mL(1) 、 1mL(2) 、（ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3-6 ）等六、实验试剂配制及实验步骤

（一）酪氨酸的标准曲线

将上述各管混匀，静置 2min, 测定各管的 A 275nm，做标准曲线，曲线如下：

（二）粗酶活测定

1 试剂

（ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 L 的磷酸缓冲液， pH 配制）（ 2 ）L 的磷酸缓冲液， pH

（ 3 ）用 L 磷酸缓冲液（ pH ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸（ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 L 磷酸缓冲液（ pH ）配制

（ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液

2 方法

量取酶液 mL，加入激活剂 mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8 min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1 mL加入此管，在37℃水浴中反应10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL摇匀，静置5 min；另取样液（已激活） mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL，37℃保温10 min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1 mL，静置5 min，测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。

（三）纯化

固定体系总质量为 g，在PEG（分子量 6 000）质量分数为%，(NH4)2SO4质量分数为%，pH值为，粗酶添加量为%所组成的双水相体系下，室温下静置分相后，读取上、下相体积，计算相体积比R，分别测定上、下相的酶活力

（四）计算与结果

R = 9/17 =

粗酶活 = （–）/ * 100000 / =

上相酶活 = （–）/ * 100000 / =

下相酶活 = （–）/ * 100000 / =

酶分配系数 = 上相酶活/下相酶活 = / =