放线菌选择性分离方法综述_钱恒
放线菌选择性分离方法综述
１ 样 品来 源的选 择
绝 大多 数 的放 线菌 来源 于土壤 。但近 年来 ， 们将 人 目光投 向各 种生境 放 线 菌 的分 离 ， 括海 洋 放 线 菌 、 包 极 端 环境 放线 菌 、 内生 放 线 菌¨ 沙 漠 土 壤 等 。分 离 。、 放 线菌 新生 态 系统 调 查 对 于发 现 新 的放 线 菌 以及 最终 发
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔ ｉ ａ ｔ ｌ ｎ ｒ ｄ ｃ ｓ ｓ ｖ ｒ ｌ ｅｅ ｔ ｅ ｉｏａ ｉｎ ｍｅ ｈ ｄ ｏ ｃ ｉｎ ｃ ｔ ｓ ｉ ｅ ｅ ｔ ｙ ａｓ ｉｃ ｕ ｉｇ ｓ ｍｐ ｓｒ ｃ ： ｈ ｓ ｒｉ ｅ ｉｔｏ ｕ ｅ ｅ ｅ ａ ｃ ｓ ｌｃ ｉ ｓ ｌｔ ｔ ｏ ｓ ｆｒ ａ ｔ ｍｙ ｅｅ ｎ ｒ ｃ ｎ ｅ ｒ ， ｎ ｌ ｄ ｎ ａ ｌ ｖ ｏ ｏ
菌落数 高 １． ％和 ８９ 。 １２ ．％
范丽霞 等 对最有 利 于土壤 放线 菌分 离 的 ｒ 然 Ｉ ｌ 时 间展 开 了研究 。研究 结果 表 明 ： 土样 放置 ７ｄ和 ２ ｌｄ均
及 加热 与化学 物质 预处 理土样 对放 线 分 离效 的 影响 ，
以期 提 高放线 菌检 ｌ 率 。采 用涂 布 平 板 稀 释法 进 行 放 线 叶 Ｉ 菌 的分 离 ， 为达 到更好 的分 散效果 ， 物理机 械 （ 玻璃 珠抓 荡
已知生 物活性 代谢 产物 的放线 菌 。
ｒｅ ｍ ｅ ｔｃ ｌｉａｉ ｎ，ｅｃ． ｉｈ ｎ ｕｔｖ ｔｏ ｔ
Ｋｅ ｒ ｓ Ａｅｉ ｏ ｃ ｔｓ Ｉｏａ ｉｎ ｍｅ ｈ ｄ ； ｕ ｙ ｗｏ ｄ ： ｔ ｍｙ ｅｅ ；ｓ ｌ ｔ ｔ ｏ ｓ Ｓ ｍｍａ ｉ ｔ ｎ ｎ ｏ ｒｚ ｉ ａｏ
放线菌的选择分离培养
（2）取土样5g，摊平于大号培养皿上，在恒温干燥箱中 120℃干热处理1h。
（3）土样热处理后，加入装有45mL无菌水和少量玻璃珠 的三角瓶中，加入0.5mL的笨酚，室温下振荡30分钟， 静止5分钟，取上清液用无菌水稀释10倍。同时另取土 样5g，不加热和笨酚处理，余步骤同上，作为对照。
实验一 放线菌的选择分离与计数
一 教学要求
放线菌有多种代谢产物，如抗生素，维生素、氨基酸、 蛋白质、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等，很多产物在农业、 医疗、食品及国防等领域产生了巨大的效益。
本实验的目的在于学习从土壤等环境中分离放线菌
精选ppt
1
二 实验原理
土壤中含有丰富的放线菌，但主要是链霉菌，链 霉菌以外的其他放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、 诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。但 往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离 方法很难得到。对样品进行风干、干热处理、培养基 添加重铬酸钾的方法减少细菌和真菌的数量；用干热 和苯酚处理减少链霉菌数量的方法，可以分离得到更 多种类的放线菌。
（2）注意在培养基中添加重铬酸钾适量
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六 思考题
请设计一种分离稀有放线菌的实验方案
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7
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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2
三 材料与器材
菜园土或林地土，自然风干，备用。 0.1％ 重铬酸钾溶液，1％ 苯酚，高氏1号
培养基。 水浴锅等。
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四 操作步骤
取样及预处理
1、来源：土壤中放线菌最丰富，品种齐全。可以筛选新的放线菌。 从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线 菌，从淡水和海洋环境中分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告
土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验目的：1、从土壤中分离产抗生素的放线菌2、放线菌的培养3、放线菌的发酵产生活性物质4、放线菌产生的活性物质提取。
实验原理：放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。
许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。
采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。
产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。
实验器材：1、土壤2、培养基：高氏一号培养基、种子培养基、发酵培养基3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。
实验步骤：一、土壤放线菌株的采集采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。
样品（土壤）处理：室温风干二、土壤中放线菌的分离、培养1、配制淀粉培养基淀粉琼脂培养基（高氏培养基）可溶性淀粉2g；硝酸钾0.1g；磷酸氢二钾0.05g；氯化钠0.05g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.001g；琼脂2g；水100ml.先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。
加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。
调整PH到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。
2、土壤悬液梯度稀释①将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。
②用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。
③按1：:1稀释至10-3、10-4、10-5，将3块灭菌平板分别标记10-3、10-4、10-5 ，稀释过程应在无菌条件下进行。
放线菌的分离与筛选方法
放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。
腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。
放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。
1.拮抗放线菌的筛选方法：1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。
如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。
可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。
选择抑制活性强的复筛。
1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。
若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。
若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。
1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。
2.放线菌分离与筛选.2.1培养基；2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%）3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。
2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。
海洋放线菌分离方法
5 抑制剂
分离 海 洋 放 线 菌 一 般 都 需 要 使 用 抑 制 剂, 建 议 用 放 线 菌 酮 ( 100 或 50 mg / 1 000mL ) 或制霉菌素 ( 100m g /L ) 加萘啶酮酸 ( 20~ 25mg /1 000mL ) 。也可以用放线 菌酮 ( 100 或 50m g / 1 000mL ) 或制霉菌加利富平 5~ 10m g / 1 000m L。 参考文献
A3, En terocin, A ctp heno, l m a ltophilin, echinom ycin , anti m yc in A, sporav iridin A1 , ba filom ycins, filipin , lipom ycins , lagosin, aboyssom icins, ikarugam ycin, elalom ycin ,
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国家 973项目 ( N o 2004CB719601 ) 国家自然科学基金项目 ( N o 30270004、 30560001 ) 通讯作者 Te: l 0871 5035263, Fax: 0871 5173878 , E m ai: l 收稿日期 : 2006 04 12, 修回日期 : 2006 05 19 lihxu@ ynu edu cn
[ 3] 7
。用这种方法可以分离到大量
4 培养基
( 1) M 1 培养基 : 淀粉 10g, 酵母膏 4g , 蛋白 胨 2g, 琼脂 18g 天然 海水定容 至 1 000 m L。
2006 年 33 ( 6)
微生物学通报
155
图 1 微囊化分离难培养放线菌流程图
( 2) M 2 培 养 基: 甘 油 6 m L, 精 氨酸 1g, K 2 H PO4 0 5g, K2 H PO4 0 5 g , M gSO4 0 5g, 琼脂 18g, 天然海水定容至 1 000 mL。 ( 3) M 3 培养基 : 葡萄糖 6g , 几丁质 2g, 琼脂 18g, 天然海水定容至 1 000 mL ( 4) M 4 培养基 : 几丁质 2g , 琼脂 18g , 天然海水定容至 1 000 mL ( 5) M 5 培养基 : 琼脂 18g, 天然海水定容至 1 000 mL ( 6) 几丁质琼 脂: 几 丁质 2g , K2 H PO4 0 7g, KH 2 PO 4 0 3g , M gSO4 0 5g , 琼脂 20g , 天然海水定容至 1 000 mL ( 7) 海藻糖 - 脯氨酸培养基 : 海藻糖 5g , 脯氨酸 1g , ( NH 4 ) 2 SO4 1g , NaC l 1g, CaC l2 2g, K 2H PO4 1g , M gSO4 7 H 2 O 1g, 复合维生素 (维生素 B1 、核黄素、烟酸、维生 素 B6 、泛酸钙、肌醇、 p- 氨基苯甲酸各 0 5m g, 生物素 0 25m g) , 琼脂 20g , 天然海 水定容至 1 000 mL。 HV 培养基的分离效果也较好。
放线菌的分离
实验五：土壤中放线菌的分离实验学时：5学时实验类型：验证性实验、综合性实验实验要求：必修一、实验目的从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。
了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。
二、实验内容筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。
迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。
土壤中放线菌最丰富，品种齐全。
通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。
随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。
从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。
但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。
对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。
用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。
土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。
注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。
首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。
常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。
其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。
抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。
三、实验原理、方法和手段原理一：稀释涂布平板法；如图1。
原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量；原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影响放线菌的生长。
四、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。
放线菌选择性分离方法综述_钱恒
放线菌选择性分离方法综述钱恒段淑蓉*（南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏南京211171）摘要：综述了近年来选择性分离放线菌的几种方法，包括样品来源的多样化，物理机械与化学分散剂结合法，稀有碳源的选择，CaCl2富集培养等。
关键词：放线菌；分离方法；综述中图分类号Q939.13文献标识码A文章编号1007－7731（2011）15－60－02Summarization of Selective Isolation Methods for ActionmycetesQian Heng et al．（Nanjing Xiaozhuang College，School of Biochemical and Environmental Engineering，Nanjing211171，China）Abstract：This article introduces several selective isolation methods for actionmycetes in recent years，including sample source diversification，combining physical mechanical approach and chemical dispersant，rare carbon sources，CaCl2en-richment cultivation，etc．Key words：Actinomycetes；Isolation methods；Summarization放线菌是一类重要的微生物，能产生有用的酶［1－2］和二次代谢产物如抗生素、生物活性分子和抗肿瘤化合物等［3－5］，具有重要的经济价值。
发现新的生物活性代谢产物的有效方法是通过分离新的微生物尤其是产生70%的已知生物活性代谢产物的放线菌［6］。
近年来，分子生物学方法已经证明，自然界实际存在的绝大部分放线菌仍然难以培养。
微生物学实验 课题设计方案
海南师范大学从环境中分离放线菌实验设计方案专业：生物科学班级：2010级一班组长：陈丽娟组员：李万蕊、曹露露、朱嘉宁时间：2012年5月24日一、实验目的1、学习从土壤中分离放线菌的方法。
2、练习、掌握微生物接种、移植和培养的基本技术。
掌握无菌操作技术。
3、掌握无菌操作技术。
二、实验原理放线菌是原核生物，是重要的抗生素产生菌，在土壤中的数量仅次于细菌，尤其在有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤中的数量较多[1]。
土壤颗粒的分散程度对于分离放线菌也有影响。
钱恒段等[2]报道，用胆酸钠处理土壤悬液后土壤分散效果较好，且优于纯蒸馏水。
这可能是因为胆酸钠对土壤腐殖质具有较强的结合能力从而有利于破坏土壤团聚结构。
据杨宇容等[3]报道,重铬酸钾对土壤真菌、细菌的抑制作用较明显，然而对放线菌并无抑制作用。
而且其价格低廉，如安德荣等[4]报道其可作为理想的放线菌分离抑制剂。
徐成勇等[5]实验证明酵母膏、SDS（十二烷基硫酸钠）也有抑菌的作用。
本实验所用方法为综合徐成勇等[5]及钱恒段等[2]实验结果所得。
三、实验材料1、样品干燥的营养基质丰富的苗圃土2、仪器铲子、牛皮纸、搪瓷杯、锥形瓶、玻璃棒、烧杯、小试剂瓶、标签纸、移液管、接种环、试管、记号笔、酒精灯、电子天平、电炉、恒温培养箱、加压蒸汽灭菌锅、电热干燥烘箱3、培养基及试剂配制（1）培养基（高氏一号琼脂+重酪酸钾培养基)配制:配方：可溶性淀粉20g、K2HPO4 0.5g、1mol/LNaOH、MgSO4•7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4•7H2O 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、250mg重酪酸钾、PH7.2~7.4。
步骤：用搪瓷杯先量取500ml自来水在电炉上加热。
根据配方，依次称取各种药品加入搪瓷杯中，搅拌均匀。
可溶性淀粉称入烧杯中，加入50ml 自来水调成糊状，待培养液煮沸时加入淀粉糊，边加边搅拌，防止糊底。
之后，加入琼脂煮沸至完全溶化，补足1000ml水量。
土壤中放线菌的分离和纯化实验(精选5篇)精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版土壤中放线菌的分离和纯化实验（精选5篇）第一篇：土壤中放线菌的分离和纯化实验土壤中放线菌的分离和纯化实验一、实验目的1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。
2、掌握培养基的灭菌方法。
掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。
4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；5、掌握高氏一号培养基的配制方法；6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。
7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。
二、实验材料高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、酒精棉球、镊子、电子天平、称量纸、烧杯、量筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀三、实验原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）第 1 页或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。
四、实验步骤1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制母液。
2、配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4℃保存；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
琼脂块法筛选放线菌的分离流程
琼脂块法筛选放线菌的分离流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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土壤中放线菌的分离与应用
土壤中放线菌的分离与应用摘要：放线菌属于原核生物，呈菌丝状生长，繁殖方式为孢子繁殖，因其在固体培养基上呈现辐射状生长而得名。
放线菌在自然界中的分布广泛，通常以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，随着人们对微生物应用的重视，放线菌被广泛的应用到人们的生产生活中。
本文主要以土壤中的放线菌为主，在学习了“微生物的培养与应用”知识的基础上，探讨了土壤中放线菌的分离与应用。
关键词：土壤；放线菌；分离；应用引言：放线菌作为一种有广泛发展前景的微生物资源，掌握其从土壤中的分离方式及在人们生产生活中的应用，不仅能够激发学生对生物知识学习的兴趣，还能让学生意识到生物与生活的联系性，从而培养学生良好的生物学科素养。
同时通过实验教学，培养学生的动手能力和操作能力，使学生能够在实际的操作中深化对理论知识的理解和掌握，帮助学生打开新奇的微生物世界。
1土壤中放线菌的分离方式在从土壤中分离放线菌前，需要根据实际情况，制定实验教学方案，带领学生了解实验中会用到的工具和器材，帮助学生学习实验方法，由于本次实验是在学生学习“微生物的培养与应用”专题后进行的，学生已经掌握了微生物培养的相关知识，因此此次实验操作对于学生来说难度较小。
1.1实验目的①掌握配置合成培养基的一般方法②了解稀释倒平板法/平板划线法/涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和操作技术。
1.2实验材料①药品：可溶性淀粉、含有放线菌的土壤、硝酸钾（KNO3）、氯化钠（NaCl）、磷酸二氢钾（K2HPO4）、硫酸镁（MgSO4）、硫酸亚铁（FeSO4）、琼脂。
②用具：高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、酒精灯、牛皮纸、无菌培养皿、铁锹、小铲、镊子等。
1.3实验步骤①制作培养基：称取20g可溶性淀粉、1gKNO3、0.5gNaCl、0.5gK2HPO4、0.5gMgSO4、0.01gFeSO4、20g琼脂、1000ml水，用冷水将淀粉调成糊状，倒入沸水中，边搅拌边加入其他药品，溶化后补足水分至1000ml，放入高压蒸汽灭菌锅112℃灭菌20min。
放线菌分离方法的研究
放线菌分离方法的研究引言放线菌是一类具有重要生物活性的微生物，在医药、农业、环保等领域具有广泛的应用价值。
因此，针对放线菌分离方法的研究具有重要意义。
本文旨在综述放线菌分离方法的研究现状、最新研究成果以及实验方法，为相关领域的研究提供参考。
研究现状传统的放线菌分离方法主要包括平板划线法、稀释涂布法、摇瓶法等。
这些方法在分离不同类型的放线菌方面具有一定的效果，但也存在一些问题，如操作繁琐、分离效率低、难以获得纯培养等。
随着分子生物学技术的发展，一些新型的分离方法逐渐应用于放线菌的分离。
分离方法的研究近年来，研究者们针对放线菌分离方法进行了大量研究。
其中，基于分子生物学技术的方法主要包括：基于16S rRNA基因的克隆文库法、基于宏基因组学的直接培养法等。
这些方法具有较高的分离效率和准确性，但需要较为复杂的操作流程和较高的实验成本。
另外，还有一些新型的分离方法，如基于细胞表面展示技术的分离方法、利用特异性抗体进行免疫分离等方法，这些方法具有较高的专一性和灵敏度，但需要制备特定的细胞系或抗体。
分离效果的评价为了客观地评价不同放线菌分离方法的效果，我们需要建立一套有效的评价体系。
该体系应包括以下几个方面：1）分离纯度：即分离得到的菌落中是否含有其他杂菌；2）分离效率：即单位时间内分离得到的纯度高且数量多的菌落数；3）操作简便性：即实验操作是否简单易行；4）经济性：即实验成本是否低廉。
通过对比不同方法的实验数据，可以较为全面地评价各种方法的优劣。
实验流程本实验采用传统的平板划线法、稀释涂布法、摇瓶法以及最新的基于16S rRNA基因的克隆文库法进行放线菌分离。
首先，采集样本并进行预处理，以提高样本中放线菌的存活率。
然后，根据不同方法的操作要求进行接种和培养。
在分离过程中，需要注意严格无菌操作，避免杂菌污染。
对分离得到的菌落进行纯化培养和分子生物学鉴定。
结果与分析通过对比实验数据，我们发现基于16S rRNA基因的克隆文库法在分离效果上具有明显优势。
海洋稀有放线菌的选择性分离方法
海洋稀有放线菌的选择性分离方法原野;何山【摘要】During last two decades, marine rare actinomycetes has become research focus for natural products development due to their significant biodiversity and particular secondary metabolites. However, the further research has been largely limited by hardship in obtaining pure culturewith traditional methods. This review summarizes the pretreatments and enrichments of the samples and the selection of medium and antimicrobial agents. The high-throughput and in-situ culturing techniques are also introduced.%介绍了当前海洋稀有放线菌分离中对样品常用的预处理和富集技术、培养基及抑制剂的选择方法以及高通量/原位富集培养技术，指出了海洋稀有放线菌选择性分离方法的重点改进方向，以进一步促进海洋难培养微生物资源的开发和利用。
【期刊名称】《宁波大学学报（理工版）》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】6页(P12-17)【关键词】海洋稀有放线菌;选择性分离;高通量培养;原位富集培养【作者】原野;何山【作者单位】宁波大学海洋学院，浙江宁波 315211;宁波大学海洋学院，浙江宁波 315211【正文语种】中文【中图分类】Q939.13放线菌是微生物活性天然产物的主要来源,在迄今发现的 22000余种微生物来源活性化合物中, 约 45%产生于放线菌, 尤其是链霉菌属[1]. 稀有放线菌(rare Actinomycetes)是指链霉菌属以外的放线菌, 用传统分离方法得到稀有放线菌概率比得到链霉菌要低很多[2]. 随着陆生放线菌中发现化合物的重复率日益增高, 近20a来, 对海洋环境中稀有放线菌的研究, 逐渐成为天然产物研究领域的热点之一. 稀有放线菌广泛分布于海洋环境中[3], 海洋环境和地理形态的多变性和特殊性, 造就了海洋中微生物的多样性[4], 这些放线菌可以产生多种具有优良生物活性且结构新颖的化合物. 但迄今分离得到的微生物尚不足自然界微生物总量的 1%, 表明数以百万计的微生物物种尚未被发现[5]. 海洋稀有放线菌的生长极易被细菌、真菌和链霉菌抑制,较难获得纯培养, 因此如何有效地选择性分离是当务之急.1 选择性分离方法选择性分离方法包括对环境样品进行预处理与富集、培养基成分的改进、合适抑制剂的添加,或有关的创新分离技术等. 综合运用这些方法能显著地提高稀有放线菌的分离效果.1.1 样品的预处理及富集为了避免因地表径流引入的陆生放线菌对分离产生干扰, 样品采集应远离海岸[6], 且沉积物取样要使用样品采集器或人工采集表层以下的样品.从自然环境中采集的样品, 如不经预处理而直接培养, 细菌会严重污染真菌和放线菌分离培养基. 放线菌是一类革兰氏阳性细菌, 主要以孢子形式萌发, 其孢子对外界刺激具有很强的耐受性,适当的处理能刺激其孢子萌发. 而一般细菌细胞壁相对较薄,易发生质壁分离而失去生命力[7]. 因此, 利用放线菌孢子抗逆性强的特点, 在样品分离前进行适当的预处理, 可以达到较好的分离效果.1.1.1 干燥及干/湿热处理天然沉积物样品可采取自然风干、湿热(50℃,6min)、干热(120℃, 1h)预处理方法, 结合1.5%的苯酚, 可有效地抑制细菌的生长并刺激稀有放线菌, 例如游动放线菌属(Actinoplanes)、戈登氏菌属(Gordonia)、小双孢菌属(Microbispora)、小单孢菌属(Micromonospora)、诺卡氏菌属(Nocardia)和野野村氏菌属(Nonomuraea)等分离[8-9]. 较其他稀有放线菌, 罕见的链孢囊菌属(Streptosporangium)因其孢子有承受和抵御外界物理或化学预处理的特性,很难用传统的方法分离. 因此对天然样品的干热处理(120℃, 1h)可显著诱导该属菌株的生长[10].1.1.2 苯酚处理苯酚对细菌、真菌和链霉菌均有杀灭作用. 因此, 用 1.5%的苯酚处理可去除或减少对其敏感的微生物[11]. 在国内外相关研究中, 马杜拉放线菌属(Actinomadura)、小双孢菌属、小单孢菌属、诺卡氏菌属、野野村氏菌属、红球菌属(Rhodococcus)以及疣孢菌属(Verrucosispora)等稀有放线菌属的分离均添加了1.5%苯酚[12]. Istianto等[13]采用1.5%苯酚预处理后, 从泥土样品中分离得到的小单孢菌属、马杜拉放线菌属、小双孢菌属以及多形态孢菌属(Polymorphospora)总和多达75.4%. 需要注意的是, 通常处理后的苯酚要稀释以去除其毒性.1.1.3 碳酸钠处理经碳酸钠处理后的自然样品能分离出更多的稀有放线菌[14], 但其机理尚不明确. Tsao等[15]报道了将自然样品与碳酸钙粉末混匀, 样品pH的变化有利于放线菌生长, 且钙离子能刺激放线菌气生菌丝的形成. Qin等[16]用碳酸钙富集和再水化-离心法(Rehydration and Centrifugation, RC), 首次从内生环境中分离得到糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、迪茨氏菌属(Dietzia)、芽生球菌属(Blastococcus)、指孢囊菌属(Dactylosporangium)、原小单孢菌属(Promicromonospora)、厄氏菌属(Oerskovia)、珊瑚放线菌属(Actinocorallia)以及姜氏菌属(Jiangella)等稀有属放线菌. 从土壤样品中分离稀有放线菌属时, 碳酸钙处理与其他处理方法结合使用其效果更好[17].1.1.4 微波辐射Ferriss[18]报道了对土壤进行微波辐射处理可以减少真菌和原核生物在土壤浸出液中的总量,且能显著地增加包括小单孢菌属、小多孢菌属(Micropolyspora)、诺卡氏菌属(Norcardia)以及马杜拉放线菌属等稀有放线菌在土壤样品中的数量[19].Bredholdt等[20]用传统分离方法从挪威特隆赫姆峡湾 450m深处采集的海底沉积物中只分离到链霉菌属和小单孢菌属, 经紫外线照射、超高频和极高频辐射预处理后再分离得到了11个不同的属.1.1.5 差速离心离心处理可去除链霉菌及其他非可动放线菌,从而有效分离可动放线菌[21]. 酶解和差速离心方法非常适用于从内生环境中分离包括假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、小单孢菌属、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、诺卡氏菌属、野野村氏菌属、马杜拉放线菌属、戈登氏菌属、原小单孢菌属和分枝杆菌属(Mycobacterium)等在内的稀有放线菌[22]. Maldonado等[23]报道了分散差速离心(Dispersion and Differential Centrifugation,DDC)方法较传统的震荡分离方法对底泥样品的分散效果更好.1.1.6 趋化法Palleroni[24]利用游动孢子囊, 特别是游动放线菌属的孢子囊能被Cl-和Br-吸引的特性, 加入KCl缓冲液, 在特殊设计的分离装置中选择分离得到该属放线菌. Hayakawa[25]报道了包括游动放线菌属, 指孢囊菌属及短链游动菌属(Catenuloplanes)在内的可以形成游动孢子的稀有放线菌, 可以通过添加木糖、氯化物、溴化物、γ-三甲基吡啶以及香草醛等趋化物分离得到. 在分离草孢菌属(Herbidospora)、小双孢菌属、小四孢菌属(Microtetraspora)和链孢囊菌属等稀有放线菌时,可以通过氯胺处理[26].与样品预处理不同, 分离工作前对自然样品的富集处理的目的在于促进目标微生物的生长[27].Magarvey等[28]将裁切为合适大小的纤维素纸放置于琼脂培养皿上,再将样品分散于纤维素纸的表面, 以分离沉积物样品中生长缓慢的放线菌.Mincer等[29]在沉积物样品中添加了卡那霉素、万古霉素、庆大霉素以及四环素, 利用盐孢菌属(Salinispora)放线菌耐药性分离得到 366株该属放线菌.1.2 培养基及抑制剂的选择选择合适的营养成分及添加量, 从而接近微生物原始的自然生存环境, 在稀有放线菌的分离培养中十分重要. Hayakawa等[30]发明腐殖酸-维生素琼脂(HVA), 是稀有放线菌分离的里程碑之一[27].该培养基中腐殖酸是唯一碳源和氮源, 很适合从天然样品中分离稀有放线菌, 而且黑色的腐殖酸培养基背景便于辨认和分离白色的放线菌菌落.1.2.1 培养基成分选择可溶性淀粉、甘油、葡萄糖等放线菌偏爱的碳源在放线菌分离中使用十分广泛, 同时尝试非常见碳源, 在稀有放线菌的分离探索中也是有益的.彭云霞等[31]用海藻糖、丙烯酰胺、EDTA和吗啉丙磺酸作为碳源, 分离得到的稀有放线菌总数均超过 50%. 用格兰胶(gellan gum)代替琼脂作为培养基固化剂, 可以提高微生物的可培养性[32]. 采用新颖的分离放线菌 Trap技术, 格兰胶培养基分离得到的稀有放线菌数量也大大超过琼脂培养基[33].在分离培养基中添加生长因子也是选择性分离的有效手段[3], 如各种放线菌生长所必需的维生素等.1.2.2 抑制剂选择许多稀有放线菌都对广谱抗生素有耐受性,因此在稀有放线菌的分离中常加入抗生素以抑制细菌和快速生长的放线菌[34]. 在分离培养基中加入新生霉素可使小单孢菌属的出菌率显著增加[35],庆大霉素也是分离该属常用的抑制剂. Bian等[36]在拟无枝酸菌属的分离中加入放线菌酮(50μg·mL-1)、硫酸新霉素(4 μg·mL-1)和制霉菌素(50 μg·mL-1). 在放线菌的分离中, 添加100μg·mL-1的放线菌酮或制霉菌素和20μg·mL-1的萘啶酮酸、50～75μg·mL-1的重铬酸钾可以有效地抑制真菌和细菌, 且不影响放线菌的生长[37].2 分离技术海洋稀有放线菌传统分离培养技术是对自然样品进行多种预处理或富集培养后, 用稀释涂布或者 Stamping/Scraping的方法在含有抑制剂及一定盐分的选择培养基上完成接种, 在合适环境下培养纯化并获得纯培养的过程. 近些年, 随着对难培养微生物研究的深入, 高通量和原位培养分离技术应运而生.2.1 传统分离技术目前绝大多数海洋及陆生稀有放线菌分离依然采用稀释涂布的方法进行接种。
放线菌的分离和鉴定
放线菌的分离和鉴定实验器材：1.土壤材料 5 ---10cm 处土壤，放于采集袋中带回实验室。
2.培养基淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基( w /v)）可溶性淀粉2%，KNO3 0. 1%，NaCL 0. 05%，K2HP04 0. 05%，MgSO4 0. 05%，FeSO4 0. 001%，琼脂2% 3.溶液和试剂（1) 20% 甘油( 2) 0. 1%美蓝 A 液: 美蓝0. 3g ，95% 乙醇300ml;B 液: 0. 01% KOH 100ml 混合A 和B 液即成革兰氏染液3( 1) 结晶紫染色液: 甲液结晶紫2g，95% 乙醇20ml;乙液草酸铵0. 8g，蒸馏水80ml。
甲乙液先分别溶解，然后混合在一起，过滤除去残渣后装入滴瓶中备用。
( 2) 碘液: 碘1g，碘化钾2 个，蒸馏水100ml 先取少量蒸馏水加入碘和碘化钾，使碘完全溶解后再加入全部蒸馏水，分装于滴瓶中备用。
( 3) 复红酒精溶液: 碱性复红0. 4g，95%乙醇100ml，溶解装入滴瓶备用。
4.仪器和其他用品无菌纸、带玻璃珠的三角烧瓶、1ml无菌吸管、无菌试管、无菌培养皿一.目的要求：1. 掌握倒平板的方法和常用分离纯化微生物的基本操作。
2. 初步观察土壤中放线菌菌落形态。
3. 初步了解掌握微生物分类的基本方法。
二.实验原理：放线菌在自然界中主要生存于陆地和淡水中，土壤为这类微生物的主要习居场所，无论在种类和数量上都比其他地方繁多。
在中性或偏碱性的土壤和有机质等丰富的土壤中较多。
放线菌以孢子和菌丝片段的形式存在于土壤，每克土壤内含有数万、数十万的孢子。
放线菌的生活史和形态特征放线菌的孢子和孢囊孢子在适宜的环境下吸收水分，膨胀萌发，生出芽管1 －3 个，芽管伸长长出分枝，分枝越来越多，形态菌丝体。
因其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。
基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。
土壤中稀有放线菌的选择性分离方法_郭丽娜 (1)
４８９放线菌是具有很高实用价值的一类微生物，作为生物活性物质的主要产生菌早已成为人们研究的焦点。
目前，从微生物中发现１００００余种抗生素，约７０％为放线菌所产生。
不仅如此，放线菌还会产生酶制剂、氨基酸等有用物质。
因此，对放线菌资源的调查与开发显得尤为重要。
并且由于新物种具有产生新生物活性物质的潜力，人们开始尽可能寻找新放线菌，特别是用常规方法很少分离到的稀有放线菌。
根据Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ最早的概念，稀有放线菌是指那些用传统方法分离时，分离频度远低于链霉菌的放线菌。
稀有放线菌在土壤中分布量少，在人工培养基上生长缓慢，有的还有特殊的营养要求，按一般的分离和培养方法，获得的菌量很少。
近年来即认为链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属以外的为所谓稀有放线菌属。
分离这些稀有放线菌，不仅可以减少对产生已知生物活性物质菌株的重复分离，还可扩展放线菌次生代谢产物的化学多样性。
几十年来，科研工作者发现，稀有放线菌能产生众多生物活性物质，包括红霉素、利富平、马杜拉霉素、洋红霉素等抗生素、酶类、维生素等。
其中一些抗生素已商业化，产生巨大的社会和经济价值。
研究结果表明，环境中只有极少一部分微生物得到纯培养。
因此，分离未知放线菌是利用它们的首要前提之一。
１、土壤预处理绝大多数的放线菌来源于土壤。
采集好土壤后的第一步是土壤的预处理，即对土壤样品或刚收集的水生地样品进行特殊的处理，用物理方法或化学方法来达到目地。
不同的实验室对于预处理也有自己独到的方法。
江翠翠等研究了不同物理机械与化学分散剂结合及加热与化学物质预处理土样对放线菌分离效果的影响，以期提高放线菌检出率。
采用涂布平板稀释法进行放线菌的分离，为达到更好的分散效果，物理机械分散常与化学分散相结合，促进微生物与土粒的分离。
范丽霞等对最有利于土壤放线菌分离的自然风干时间展开了研究。
研究结果表明：土样放置７天和２１天均适合放线菌的分离，放置７天的放线菌菌落较多，种类也较齐全，而细菌和真菌数量下降较快。
植物叶片内生放线菌的分离、分类与拮抗活性
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植物叶片内生放线菌的分离、 分类与拮抗活性
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摘
要： 以四川采集的芍药和北京采集的三叶草的叶片为材料， 经表面消毒程序后， 分离出内生放线菌 &# 株。通
［"］ ［C］ 酵母酪素琼脂（X9H[） 、 和 &3&% 营养琼脂（ KL） ［C］ 水琼脂（ WL） 。除 WL 外， 其余培养基均补充放 线菌酮和制霉菌素各 #% ! ?3:\。 GHI 试剂购于上海
放线菌的分离与提纯 论文
放线菌的分离与提纯摘要：放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，革兰染色为阳性的单细胞原核微生物，是细菌中的一种特殊类型。
放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，在医药工业上有重要意义。
本实验我们主要采用无菌培养、稀释法等方法对放线菌进行培养、分离和纯化，经过倒平板、制备梯度稀释液、涂布、培养、挑单菌落、保存等步骤即可使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。
关键词：放线菌分离无菌一、实验目的学习从土壤中分离放线菌。
二、实验原理放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。
一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。
由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。
根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。
如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。
再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。
三、仪器与材料（一）培养基（二）．溶液或试剂10%酚液，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。
（三）.仪器无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、链霉素和土样、显微镜、电热恒温水浴锅涂布器等。
（四）.流程倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→挑单菌落→保存四、操作步骤（一）．来源土壤中放线菌丰富，品种齐全，可以筛选出新的放线菌。
（二）．培养基的制备1、称量和溶化按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。
然后再称取其他各成分，并依次溶化，对微量成分FeSO4 ．7 H2 O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入。
稀有放线菌的选择性分离方法_彭云霞
云南大学学报(自然科学版),2007,29(1):86~89CN53-1045/N ISSN0258-7971 Journal of Yunnan University稀有放线菌的选择性分离方法彭云霞1,3,姜 怡1,2,段淑蓉1,李文均1,徐丽华1(1.云南大学教育部微生物资源重点实验室,微生物药物国家工程研究中心,云南省微生物研究所,云南昆明 650091;2.德国基尔大学海洋研究,D sternbroo ker Weg20,D-24105K iel;3.云南省出入境检疫局,云南昆明 650031)摘要:为了设计稀有放线菌的分离方法,对噬菌体S7,S3,重铬酸钾、萘啶酮酸、利富平、硫酸庆大霉素、柱晶白霉素、放线酮、制霉菌素等抑制剂及几种碳源进行了试验,设计或改良了几种培养基,研究它们分离稀有放线菌的效果.发现噬菌体能有效降低常见链霉菌的出菌率,重铬酸钾抑制真菌、细菌的效果好,M OPS、海藻糖、丙烯酰胺和乙二胺四乙酸能提高稀有放线菌的出菌率.推荐海藻糖-脯氨酸培养基、改良高氏2号、改良脯氨酸培养基作为稀有放线菌分离培养基.还提供了一些分离稀有放线菌的经验.关键词:稀有放线菌;分离方法;培养基中图分类号:Q93-331 文献标识码:A 文章编号:0258-7971(2007)01-0086-04放线菌是一类重要的微生物资源,它是抗生素及其他生物活性物质的主要生产者[1].几十年来,科研工作者发现,稀有放线菌能产生众多生物活性物质,包括红霉素、利富平、马杜拉霉素、洋红霉素等抗生素、酶类、维生素等.其中一些抗生素已商业化,产生巨大的社会和经济价值.研究结果表明,环境中只有极少一部分微生物得到纯培养.因此,分离未知放线菌是利用它们的首要前提之一.由于链霉菌已经大量被发现,排除已知链霉菌的干扰,也是设计分离程序要考虑的重要问题之一.一些实验室曾经在特定类群放线菌的分离方面进行过研究,但稀有放线菌的出菌率仍然偏低[2~5].本文报道稀有放线菌(系指链霉菌以外的放线菌)选择性分离方法研究的部分结果.1 材料和方法1.1 土样来源 土样于2004年2月采自中国云南省南部西双版纳地区、老挝和泰国等,包括热带雨林、常绿阔叶林、松林和混交林等多种生态环境,按照采样地点、生态环境,混合成1~10号样品,用于本实验.1.2 噬菌体 从德国天然产物化学研究所(H KI)获得2株噬菌体:S3和S7.1.3 抑制剂 硫酸庆大霉素100 g/mL,柱晶白霉素20 g/mL,利富平20 g/mL,制霉菌素100 g/mL,放线酮100 g/mL,重铬酸钾50 g/mL,萘啶酮酸20 g/mL.在海藻糖-脯氨酸培养基和改良高氏二号改良培养基中分别加入1种或2种抑制剂分别进行实验.1.4 分离培养基(1)几丁质培养基(1000mL,下同):几丁质2 g,K2HPO4 3H2O0.92g,KH2PO40.3g, MgSO4 7H2O0.5g,FeSO40.001g,ZnSO40.001 g,M nCl20.01g,琼脂20g,pH7.0.(2)土壤浸汁培养基:土壤浸汁1000m L (400g土壤,1000mL水,1 105Pa灭菌1h,过滤或离心,用上清液),蛋白胨5g,牛肉膏3g,琼脂20 g.(3)海藻糖-天门冬酰胺培养基:L-天门冬酰胺1g,海藻糖10g,K2HPO4 3H2O1.31g,微量盐1mL(FeSO4 7H2O0.2g,M nCl 2H2O0.1g, ZnSO4 7H2O0.1g,水100mL.),琼脂20g,pH 7.2~7.4.(4)海藻糖-脯氨酸培养基:海藻糖5g,脯氨收稿日期:2006-04-10基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2004CB719601);国家自然科学基金资助项目(30270004、30560001). 作者简介:彭云霞(1964- ),女,云南人,硕士生,主要从事放线菌分类方面的研究.酸1g,(NH4)2SO41g,NaCl1g,CaCl22g,K2HPO4 1g,MgSO4 7H2O1g,复合维生素(维生素B1、核黄素、烟酸、维生素B6、泛酸钙、肌醇、p-氨基苯甲酸各0.5mg,生物素0.25mg,下同),琼脂20g,pH 7.2.(5)改良脯氨酸培养基:脯氨酸5g,琼脂20 g,pH7.2.(6)改良高氏二号改良培养基:葡萄糖1g,蛋白胨0.5g,胰胨0.3g,NaCl0.5g,琼脂1.5g,复合维生素,琼脂20g,pH7.2.1.5 分离方法 分别称取2g风干土样,120 干热预处理1h;冷却至室温后,加入准备好的Na4P2O7无菌溶液中,振荡30min后,再用50W 超声波处理1min,用无菌水梯度稀释(最终稀释1000倍),涂布于平板.为了试验噬菌体,取土悬液2mL到酵母膏-麦芽膏液体培养基中,28 预培养5h;把培养液分别稀释10倍后,加入噬菌体S3和S7.再37 培养30min后,培养液稀释,涂布平板.平板在28 培养,3~5周,菌落计数,挑菌,记录结果.1.6 菌种鉴定 以菌落形态观察为主,结合光学显微镜进行形态特征观察,同时参照Lechevalier 等[6]的方法分析细胞壁氨基酸的类型,将菌株鉴定到属.2 结果与讨论2.1 噬菌体的使用 实验结果表明,噬菌体对稀有放线菌的分离效果有比较显著的影响.在几丁质培养基上,未加噬菌体时,分离到链霉菌147株,稀有放线菌93株,稀有放线菌占放线菌总数的38.75%;加入100 L噬菌体S3和S7,分离到链霉菌78株,稀有放线菌110株,稀有放线菌占放线菌总数的58.51%;加300 L噬菌体时,分离到链霉菌44株,稀有放线菌76株,稀有放线菌占放线菌总数的63.33%;加500 L噬菌体时,分离到链霉菌43株,稀有放线菌93株,稀有放线菌占放线菌总数的68.38%.随着添加噬菌体数量的增加分离到的链霉菌的数量呈明显的下降趋势,当加入噬菌体的量增加到500 L时链霉菌的数量降低约70%,稀有放线菌所占比例几乎是未加时的1倍.S3-phag e是一类对S trep tomyces albus专一性的噬菌体,S7-phage是除了Str ep tomyces oli vaceus,对其它80多种链霉菌都具侵染力,而且裂解能力强[7].本实验结果表明它们能有效裂解链霉菌,相对提高了稀有放线菌的出菌率.利用噬菌体裂解链霉菌,结合使用其他选择性分离方法,用于分离稀有放线菌是切实可行的.但是有2点值得注意.第1,自然界仍然存在大量未知链霉菌,我们不清楚这2种噬菌体是否会裂解这些未知链霉菌;第2,我们也不清楚,加入噬菌体以后分离到的链霉菌是否已感染噬菌体,是否会危害未知链霉菌,因此,建议慎重使用噬菌体.2.2 抑制剂的选择 实验结果表明,利富平、硫酸庆大霉素、柱晶白霉素能有效抑制细菌的生长,但抑制真菌的效果较差,放线菌的出菌率也较低.本实验的结果表明,采用100 g/mL的放线酮或者制霉菌素和20 g/mL的萘啶酮酸,能有效抑制真菌和细菌,以达到分离较多的放线菌的目的.我们的实践多次证明,使用这一组效果良好的真菌、细菌抑制剂,几乎没有真菌的干扰,细菌也很少,对于分离稀有放线菌极有好处.同时,分离培养基加入50~75 g/mL重铬酸钾,可有效抑制真菌和细菌,而又不抑制放线菌,从而大大提高放线菌的出菌率.2.3 碳源的选择 碳源是培养基的基本成分,甘油、淀粉、葡萄糖、腐殖酸等已广泛应用于放线菌分离培养基.再使用这些碳源,常见放线菌的出菌率会很大.因此探索 稀有 碳源,用于稀有放线菌分离,是一条可试途径.吗啉丙磺酸(M OPS,morpho linepropanesulfonic acid)是一种中性缓冲剂(pH 6.5~7.9).使用海藻糖-脯氨酸培养基,用0.1%的MOPS作碳源(代替海藻糖,下同),共分离到放线菌336株,其中稀有放线菌169株,占50.3%;用0.2%的丙烯酰胺作碳源,分离到放线菌229株,其中稀有放线菌135株,占59.0%;用0.5%的海藻糖作碳源,分离到放线菌285株,其中稀有放线菌155株,占54.4%;EDTA也是一种中性缓冲剂(pH7.0~8.0)、螯合剂的代表性物质,能和碱金属、稀土元素和金属等形成极稳定的水溶性络合物,能使分离培养基维持中性环境,用0.2%的EDTA作碳源,分离到211株放线菌,稀有放线菌111株,占52.6%.因此,MOPS、丙烯酰胺、海藻糖和EDTA是分离稀有放线菌比较理想的碳源,稀有放线菌的出菌率都能超过50%,建议采用.吐温80(polyoxyethylenesorbitan monooleate or polysor87第1期 彭云霞等:稀有放线菌的选择性分离方法bate)和聚乙烯醇均可以作为乳化剂,增加土壤中部分难溶物质的溶解.用吐温80(0.5%)作碳源,分离到放线菌329株,其中稀有放线菌119株,占36.2%;用聚乙烯醇(0.2%)作碳源,分离到放线菌328株,其中稀有放线菌94株,占28.7%.十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂,对非产孢类微生物有较强的杀灭作用.分离培养基加入对氨基苯甲酸(0.2%)、十二烷基硫酸钠(SDS, 0.2%)、鞣酸(0.2%)的培养基,没有任何放线菌生长,但可以降低浓度进一步试验.2.4 选择性培养基 从表1可以看出,3种分离培养基中,改良高氏二号(1.4(6))是营养贫乏培养基,各种成分均只有高氏二号培养基的1/10,又加了混合维生素和抑制剂.在营养贫乏的条件下,对稀有放线菌产生选择性分离效果.表1所列3种培养基中,改良高氏二号培养基分离效果最佳,不仅放线菌出菌率高(908株),而且链霉菌所占比例也小,稀有放线菌比例高达81%(733株).从海藻糖-脯氨酸培养基(1.4(4))分离到1096个菌株,稀有放线菌855株,占78%,其中有小单孢菌(Mi cromonosp or a,占25%)、指孢囊菌属(Dycty losp or angium)、链孢囊菌(Strep tosp orangium)、马杜拉放线菌(Actinomadura)、小四孢菌属(Mi crotetr aspora)小双孢菌(M icrobisp ora)、双孢放线菌(A ctinobisp or a)、糖单孢菌(Saccharomonsp ora)、假诺卡氏菌(Pseudonocardia)、诺卡氏类(Nocar dia)和未能鉴定到属的菌株,表现出明显的物种多样性.从改良脯氨酸培养基(1.4(5))分离到542株放线菌,其中稀有放线菌355株,占66%.使用几丁质培养基,虽然小单孢菌较多,但这类单调.使用土壤浸汁培养基,尽管加了抑制剂,但细菌污染较重,稀有放线菌出菌率不到5%.使用海藻糖-天门冬酰胺培养基,稀有放线菌的出菌率有24%,细菌污染少,是较好的培养基.在作稀有放线菌分离时,建议采用2种培养基: 改良高氏二号培养基; 海藻糖-脯氨酸培养基和改良脯氨酸培养基中选1种.表1 不同培养基对稀有放线菌的选择性分离效果T ab.1Effectiveness of selective isolation for rare act inomycetes o n different media 培养基土样1土样2土样3土样4土样5土样6总数R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R/株A/株R A/%(4)136149252255657181232105166175237855109678(5)610891635831118012516225235554266(6)374222622833731291608812422028173390881 R:稀有放线菌的数量;A:放线菌总数;培养基编号见文1.4;3种培养基均加50 g/mL的重铬酸钾Waksman发现链霉素以后,开启对放线菌的广泛研究,大量放线菌(尤其是链霉菌)被多次重复 发现 和描述.现在要发现新的放线菌是越来越困难了.但是从现代分子生物学的研究结果看,自然界实际存在的未知放线菌至少还有90%.因此不断设计新的简便、有效的分离程序,排除已知链霉菌干扰,分离未知稀有菌仍然是放线菌资源开发的关键之一.为此,我们建议:第1,不断改变培养基的成分(尤其是碳源的种类和量),设计新的培养基.以上3种培养基可以作为分离稀有放线菌之参考;第2,抑制剂的选择很重要,我们建议使用两组抑制剂:100 g/mL的放线酮或制霉菌素+ 20 g/mL的萘啶酮酸和50 g/mL的重铬酸钾,使用噬菌体要持慎重态度;第3,加入维生素混合物常常有利于稀有放线菌的生长.参考文献:[1] 姜成林,徐丽华.微生物资源学[M].北京:科学出版社,1997.[2] 李文均,张忠泽,姜成林.几种主要稀有放线菌的选择性分离[J].国外医药(抗生素分册),2002,23:18 22.[3] CHORM ON OVA N T.Isolation o f actinomadura fromsoil sample on selectiv e media with kanamycin and rifampicin[J].A ntibiotiki,1978,23:22 26.[4] WA KI SAK A Y,KA WAM U RA Y,YASIDA Y,et al.Aselective isolation pr ocedure for micromonospore[J].J Antibiot,1982,35:822 836.[5] SUZU K I S,T A KAHASHI K,OK U DA T,et al.Selective isolatio n of act inobispor e on gellan g um plates[J].88云南大学学报(自然科学版) 第29卷Can J M icrobio l,1998,44:1 5.[6] LECHEVAL IER M P,LECHEVAL IER H A.T hechemo tax onomy of actinomy cets [J ]//Actinomy cetes T axonomy.Ar lington:SIM Spec,Publ,1980,(6):277284.[7] K U RT BOK E D I ,CHEN C F ,W ILL IA MS S e ofpo lyvalent phage for reductio n of streptomycetes on soil dilution plates[J].J Appl Bacter iol,1992,72:103 111.Selective isolation methods of rare actinomycetesPENG Yun x ia 1,3,JIANG Yi1,2,DUAN Shu rong 1,LI Wen jun 1,XU Li hua1(1.T he Key L aboratory for M icrobial Resources of M inistry of Education,T he National Engineer ingCenter for Resear ch of M icrobial P harmaceuticals,Yunnan I nst itute of M icrobiolog y,Y unnan University,K unming 650091,China;2.Leibniz Institut f r M eeresw issenschaften an der Universit a ..t K iel,D sternbrooker Weg 20,D 24105Kiel,Germany;3.Quarantine Bur eau of Y unnan Province,Kunming 650031,China)Abstract :T o selecte isolation methods of rare actinom ycetes,the effects of various phages,inhibitors,car bon resoures were tested.Based on the tested results,several medium w ere desig ned and improved.Isolation ef fects of the medium w ere compared.The results indicate that trehalose Proline ag ar,modified Gauo s 2agar and proline agar are good medium for selective isolation for rare actinomycetes.Some experiences about isola tion of rare actinomy cetes were provided.Key words :rare actinomycetes;selective isolation methods;media *******************************简讯本刊入选 首届中国高校精品科技期刊2006年10月,在教育部科技司委托中国高等院校自然科学学报研究会组织开展的 首届中国高校精品 优秀 特色期刊评比活动 中,本刊入选中国高校精品科技期刊.此次评比共评出包括本刊在内的52种精品科技期刊,98种优秀科技期刊,100种特色期刊.本刊是西南4省区(川、滇、黔、桂)仅有的2家精品高校科技期刊之一(另1家是 四川大学学报(医学版) 。
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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。