淋巴细胞亚群

机体免疫状态是衡量机体是否患病的重要指标，目前多采用流式细胞术来监测机体的免疫状态，其中最重要的指标是检测T、B和N K淋巴细胞的水平。

??????? T细胞主要包括T辅助细胞（Th）和T抑制细胞（Ts）细胞亚群。CD3+细胞代表外周血中总的成熟T细胞，理论上应约等于CD4+细胞和CD8+细胞的总和，但往往出现CD4+加CD8+细胞之和大于CD3+，这是因为CD4+细胞包括CD3+/CD4+细胞（真正Th细胞）和CD3-CD4+细胞（非Ts细胞），而后者包括CD3-CD8+CD16+56+细胞（一部分NK细胞）和CD3-CD8+CD16+56-（未知细胞）。由此可见，真正的TH细胞是CD3+CD4+细胞，真正Ts细胞是CD3+CD8+细胞。尤其当患者NK细胞明显增加时，会使CD4细胞和CD8细胞的总和远大于CD3+细胞，因此，用三色荧光标记才能分析真正的辅助性T细胞和抑制性T细胞。

??????? 首先在淋巴细胞中识别出CD3细胞，然后在CD3细胞中再区分CD4+和CD8+细胞。NK细胞的表面无T细胞和B细胞表面标志，但有CD16和CD56等标志，用CD16+56抗体能鉴定出NK细胞（一定是CD3阴性），CD3-CD16+56+细胞才是真正的NK细胞。根据是否表达CD8，又可将NK细胞分为CD3-CD8+CD16+56+细胞（所占比例小，不影响CD8比例）和CD3-CD8-CD16+56+细胞（主要成分）。

??????? B细胞的表面标志是CD19，理论上CD3-CD19+细胞才是真正的B淋巴细胞。但

CD3+CD19+细胞很少，可忽略不计，所以CD19+细胞就是B淋巴细胞。

??????? 在抗肿瘤效应中，CD4和CD8分别是T淋巴细胞的辅助／诱导细胞亚群与抑制/细胞毒细胞亚群，CD4细胞的主要功能是通过其分泌的淋巴因子，增强和扩大免疫应答过程，辅助诱导其它免疫细胞如杀伤性T细胞，B细胞等共同发挥抗肿瘤作用，CD4细胞的减少，导致免疫功能低下。CD4/CD8比值是重要的免疫状态监测指标，其比例的降低与免疫系统损害的程度相关。

??????? CD4降低见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂者；CD8降低见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病；CD4/CD8比值升高见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应、病毒感染等；CD4/CD8比值降低见于艾滋病(常小于。监测器官移植排斥反应时，CD4/CD8比值升高预示可能发生排斥反应。

淋巴细胞担负着免疫的主要功能。淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，通过

流式细胞仪检测分析即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。最常检测的亚群包括T细胞（CD3）、B细胞（CD19）、NK细胞（CD16+56）、辅助性T细胞（CD3+CD4+）和抑制性T细胞（CD3+CD8+）等等。

(1)??? 应用CD3/CD19区分T淋巴细胞和B淋巴细胞

CD3是T细胞的特异性抗原，CD19则用来识别B细胞．因此应用CD3/CD19双标试剂即可以区分和鉴定T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群；CD3、CD19阳性表达为独立的阳性细胞群体。如出现双阳性细胞均为假象。这样就可不用同型对照来设定阴性或阳性界线。此外，此检测还会出现双阴性群体，这些都是NK细胞，这些细胞也提供了双阴性群体的对照。

(2) 应用CD3/CD4来鉴定CD4+T细胞

首先用CD3来区分全部T细胞．而CD3/CD4双阳性细胞为真正的辅助/诱导性T细胞，这是HIV病毒感染的主要对象;CD3-/CD4+细胞群是由单核细胞组成，这些细胞相对于CD4+和T 细胞来说弱表达CD4，在光散射参数的位置分布也较广。所以CD3/CD4抗体组合能够完全把CD4阳性辅助/诱导性T细胞区分开。另外，应用适当的双色组合如CD4与CD29,CD4与CD45RA,也可以测定T辅助细胞的的亚群。如CD4+2H4(CD 45RA)+细胞是Ts的诱导细胞;CD4+ 4B4 (CD29)+细胞Th的诱导细胞。同理,•利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+ S6F1可测定T抑制细胞的亚群。T辅助细胞还可分成Th1、Th2两个亚群，同时标记细胞内细胞因子IFN-

γ和IL-4，可区分Th1细胞（CD4+/IFN-γ+）和Th2细胞（CD4+/IL-4+）。

（3）应用CD3/CD8鉴定CD8+T淋巴细胞

CD8的表达不只限于细胞毒性T细胞，此抗原在部分的NK细胞上也能检测到。所以利用CD3抗体才能把该细胞亚群分开。

若采用三色测定可给出更为准确的各亚群的情况:如真正的T辅助细胞应是CD3+ CD4+CD8-,真正的T抑制细胞应是CD3+CD4- CD8+,单标CD8+细胞中不仅有T抑制细胞,还含有30%左右的NK细胞;而CD3+CD4-CD8-细胞群是γδT细胞,此类细胞与感染有关．CD3+CD4+ CD8-细胞+CD3+CD4-CD8+细胞+CD3+CD4-CD8-细胞+CD3+CD4+CD8+细胞=CD3+细胞。

(4)??自然杀伤细胞（NK）的检测

①CD16(FcRⅢ)表达于大多数NK细胞上，但也表达于中性粒细胞，此抗原NK细胞的表达比较弱，并在NK细胞活化时丢失；②CD56表达于大多数NK细胞上，也表达于一些T淋巴细胞，与CD3联合使用可以区分CD3+/CD56+T淋巴细胞和CD3-/CD56+NK细胞。③联合使用3种抗体最完全地鉴定所有的NK细胞。NK细胞或表达CD16，或表达CD56，但它们不表达CD3。CD16和CD56联合使用，根据荧光强度可将NK细胞从双阴性细胞中区分出来。这样运用该试剂组合，NK细胞可形成独立的群体与其它细胞相区分。

图1 流式分析细胞亚群

??????? 外周血是临床检验中的重要标本。FCM分析外周白细胞的主要目的是了解各种白细胞的数目与分群情况。以下给出常用细胞亚群的正常范围供参考,请注意同一CD中有多种克隆的McAb,同一CD中不同McAb•所测出的数值不同,每个实验室应测定自己实验室的正常数值：

?表1 人外周血各细胞亚群表面抗原和流式检测的正常参考值