饲料微生物检测技术及安全防护-中国广州分析测试中心

安全操作规程
实验工作由于其具有特殊性，在实验操作 过程中的人身安全防护相当重要。为提高 实验人员的自我防护意识，避免意外事故 发生，规范微生物实验室内仪器、设备的 安全操作及染菌的微生物培养物处理程 序，保证微生物实验的安全操作。
4.1 压力蒸汽灭菌器的安全使用操作程序
①堆放：将需灭菌的物品予以妥善包扎，各包之间留有空隙，依次堆 放在灭菌桶的筛板上，以蒸汽穿透，提高灭菌效果。
产气 ＋ 反应模式表示：
H2S － K／A ＋；－
微生物检测操作程序
3.4 检验物品的处置
检测样品按样品保存条件要求进行保存。需冷藏的样品贮存在样品 冰箱中，并做检测状态标识。
样品称量时，在洁净室内进行，防止污染。
所有的检测样品及用具均应从经消毒的传递窗传递。
致病菌样品检测完后，需经传递窗传出到灭活间，用高温锅煮沸后 才能将其存放于废物（液）桶内。
②各种染菌的物品也应经过灭菌处理后，清洗干净方可 使用。
准备室和观察室
微生物实验室安全防护
警示标志 防止交叉污染 有毒有害物防护 消除污染和废物的处理
生物安全
打碎玻璃器皿：如遇因打碎玻璃器皿而把菌液洒到桌面或地上时，应 立即以5%石炭酸液或0.1%新洁尔灭溶液覆盖，30min后擦净。若遇皮肤 破伤，可先去除玻璃碎片，再用蒸馏水洗净后，涂上碘酒或红汞。 菌液污染手部皮肤：先用70%乙醇棉花拭净，再用肥皂水洗净。如污染 了致病菌，应将手浸于2％～3％来苏尔或0.1%新洁尔灭溶液中，经 10～20min后洗净。 菌液吸入口中：应立即吐出，并用大量自来水漱口多次，再根据该菌 的致病程度作进一步处理： ① 非致病菌：用0.1％高锰酸钾溶液漱口。 ② 一般致病菌（葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌等）：用3％H2O2、
⑤灭菌：当压力温度达到所需的范围时，开始计算灭菌所需时间，并 使之维持恒压。在应用0.145Mpa（126℃）灭菌时，则安全阀可使之 维持恒压。若采用低于上述压力温度时，则应安装一只调压变压器调 低电压来维持恒压，达到所需的压力、温度范围。
⑥开盖：灭菌结束后，切勿立即将灭菌锅内的蒸汽排出，否则：由于 液体物品的温度未能下降，而压力蒸汽突然释放，会使液体剧烈沸 腾，造成溢出或容器爆裂。应待压力表指针归零位后，方可按逆时针 方向推动上手柄，让盖上定位标尖对准下手柄中心，开启锅盖。
②因加热而明显膨胀及未经包扎散状颗粒、线条状的物品，不得进 入本器进行灭菌。否则，可能引起上述物品将安全阀汽孔堵塞，不 能正常工作而造成容器爆裂事故。
③灭菌液体时，应将液体灌装在硬质的耐热玻璃瓶中，以不超过容 器体积的3/4为宜，瓶口选用棉花塞或透气塞，切勿使用未打孔的 橡胶或软木塞，特别注意，在灭菌液体结束时，不准立即释放蒸 汽，必须待压力表指针归零位后方可排除余汽。
0.1％高锰酸钾溶液或0.02％米他芬液漱口。 ③ 致病菌：如吸入白喉棒杆菌，在用②法处理后，在注射1000U白喉抗
毒素作紧急预防；若吸入伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌或霍乱弧菌 等肠道致病菌，在经②法处理后，可注射抗生素预防发病。
衣服或易燃品着火：应先断绝火源或电源，搬走易燃物品(乙醚、汽油 等)，再用湿布掩盖灭火，或将身体靠墙或着地滚动灭火，必要时可用灭 火器。 皮肤烫伤：可用5％鞣酸、2％苦味酸（苦味酸氨苯甲酸丁酯油膏）或2％ 龙胆紫液涂抹伤口。 化学药品灼伤 ① 强酸、溴、氯、磷等酸性药剂：先用大量清水洗涤，再用5％NaHCO3或
★注意事项：
④对不同类型、要求的灭菌物品；如敷料和液体等，切勿放在一起 灭菌，以免造成损失。
⑤灭菌终了后，如压力表指针回复至零位，而盖不宜开启时，则可 将放汽阀摘子置于放汽位置，使外界空气进入灭菌器内，真空消除 后，盖可开启。
⑥压力表使用日久后，压力指示不正确或不能回复至零位，应及时 予以检修，平时应定期与标准压力表相对照，如不正常，应换新表。
HE琼脂
科玛嘉显色培养 基
菌落特征
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌 落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株 形成灰绿色的菌落，周围培养基不变
菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌 株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现 全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落， 带或不带黑色中心
蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全 部黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几 乎全黑色
所有检测后的样品（溶液）经高压灭菌灭活处理,绝不允许倾倒于下 水道中。
微生物检测操作程序
3.5 检验质量控制
检测人员应严格按作业指导书规范操作。
检测所用培养基必须从合格供应商处采购，并经验收合格。
定期参加实验室能力验证和实验室间比对活动，确保检测质量。
内部质量控制。在每次检测过程中，均需进行阳性和阴性对照实 验，如阳性和阴性实验结果正确则可判断该次检测结果有效。否则 应查找原因，重新检测。
大肠杆菌
沙门氏菌
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）革兰氏染色
革兰氏染色阳性球菌（紫色）
枯草芽孢杆菌（G+）
沙门氏菌的形态与染色特性
G-,杆菌，无荚膜和芽孢，周鞭毛（除鸡白痢和鸡伤寒沙 门氏菌外）。
沙门氏菌在各种选择性琼脂平板的典型特征
选择性琼脂平板 BS琼脂
XLD琼脂
饲料微生物检测 技术及安全防护
主讲人：黄启红
介绍内容
1 课程任务
2 微生物实验 人员及条件要求
3 微生物检测 操作程序
4 安全操作规程
了解微生物检验室的基本要求，通过学习，能独 立建设一般的微生物检验室。
认识和熟悉微生物检验中重要仪器设备，能正确 使用和进行一般的维护，掌握饲料微生物的典型 菌落特征和检测要领。 规范微生物检测的操作程序，确保检测质量,提高 实验人员的自我防护意识。
5%NaOH中和。 ② NaOH、金属钠（钾）、强碱性药剂：先用大量清水洗涤，再用5％硼酸
或5％乙酸中和 ③ 石炭酸：用95％乙醇洗涤 ④ 如遇眼睛灼伤：则应先用大量清水冲洗，再根据化学品的性质作分别
处理，例如，遇碱灼烧可用5％硼酸洗涤，遇酸灼烧可用5％NaHCO3洗 涤，在此基础上再滴入1～2滴橄榄油或液体石蜡加以润湿即可。
②加水：在锅体内注入生活用水，水位一定要超过电热管2厘米以上 （不宜过多）；连续使用时，每次操作前，必须补足上述水位，以免 烧坏电热管和意外发生。
③密封：把堆放好物品的灭菌桶放在锅体内，将锅盖上的定位标尖对 准锅体下手柄中心，用手把盖轻轻按下，按顺时针方向转动，将上、 下手柄完全合拢，让安全锁处于开着位置，当锅内升压时，安全锁自 动锁定上、下手柄。
⑦安全阀应定期检查其可靠性，工作压力超过0.170兆帕时需要更 换合格的安全阀，如未更换则不得再继续使用，否则锅内超压而安 全阀又未泄压，会造成容器爆裂事故。
全自动高压蒸汽灭菌器
鼓风干燥箱
4.2 冰箱及培养箱的安全使用注意事项
① 冰箱内严禁放入易燃易爆危险品，及强腐蚀性的酸、 碱等。
微生物检测操作程序
3.2 设施与环境条件要求
接种样品必须在酒精灯前操作，接种样品时，吸管从包装中取出 后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 从包装中取出吸管时，吸管 尖部不能触及外露部位及试管或平皿边。
实验完毕，清洁操作台面,再开紫外灯消毒 40—60分钟。洁净室 不得存放与实验无关的东西，检测结束后及时清理。
实验环境
无菌操作室室内温度 控制在18~26℃，相对湿 度45~65%，环境洁净度达 到10000级，无菌操作台 洁净度达到100级，采用 无菌空气流灭菌法和紫外
灯灭菌法相结合。
无菌操作台和生物安全柜
生物显微镜
显微镜的使用方法
用光学显微 镜观察微生物 形态时，一般 遵循先低倍镜 观察，后高倍 镜观察，再油 镜观察 。
用过的器材进行整理，污染细菌的器材需经高压灭菌或煮沸消毒, 换下的隔离衣、帽等进行高压消毒，拖鞋放回原处。
无菌室和缓冲间每周大扫除一次，保持整洁。必需定期清洁消毒。 每周用ClO2水剂清洁洁净室内所有器具及地面，每月用甲醛对洁 净室进行熏蒸。清洁灭菌后监测洁净室内细菌数、霉菌数，100 级洁净室菌落总数不超过1个/皿，10000级洁净室菌落数不超过3 个/皿，霉菌不得生长。
④加热：将灭菌器接通与名牌一致的电源，按下电源开关，接通电 源，指示灯亮，表示电源已正常输入本器，电热管开始加热工作，锅 内冷空气从透气孔排出；当锅内压力上升至0.03Mpa左右时，安全锁 自动关闭透气孔，并锁定上、下手柄，确保安全。此时压力表指针随 加热逐渐上升，指示锅内的压力、温度。
4.1 压力蒸汽灭菌器的安全使用操作程序
微生物实验操作人员职责
微生物实验操作人员进行微生物检测时，应按照相关标准 方法及本规程进行操作，并填写相关记录表。
微生物管理责任人负责洁净室的日常维护管理。 质量监督员负责对新员工进行定期监督。
微生物检测操作程序
3.1 人员要求
检测人员应熟悉生物检测安全操作知识和消毒知识，并 经培训上岗。
使用洁净室前，先打开紫外灯灭菌30分钟，同时开启洁净室净化 排风系统。
进入无菌间必须必须经缓冲通道进入，更换专用工作服、帽及拖鞋、 口罩，工作服、帽及拖鞋、口罩应放在无菌室缓冲间，工作前经紫 外线消毒后使用。非实验人员不准进入洁净室，确因工作需要或上 级部门检查工作时，经室批准后，更换鞋、衣服后进入，并登记。
②冰箱顶部不得放置电器或其它不稳定物品或有水容 器，以免掉下伤人或溢水致漏电。
③冰箱及培养箱附近不得放置其它易燃易爆物品，以免 引起火灾。
④培养箱内无物时，应关闭电源，不得空载运行。
4.3 微生物测定培养物的处理
①微生物培养物如长有细菌、霉菌，可直接加热煮沸杀 死后倒掉或经蒸汽灭菌后倒掉。如有致病菌，应采用蒸 汽灭菌法121℃30分钟，杀死所有细菌及芽孢体，灭菌 后倒掉。
菌落为紫红色
沙门氏菌Βιβλιοθήκη Baidu
普通琼脂：生长不良；
麦康凯：琼脂上形成灰白 色菌落。
SS:产生较小、黑色菌落。
BS
SS
XLD
DHL
科玛嘉显色
沙门氏菌在CHROMagar 显色培养基上的菌落特（紫）
三糖铁琼脂
① 挑取待试菌菌落穿刺接种三糖铁底部并涂布于斜面； ② 置 37℃培养。
三糖铁琼脂
斜面 产碱（红色） 底部 产酸（黄色）
现场采样时，必须有工作人员参加，并对抽样设备进行 严格消毒。采样时，佩戴手套和口罩，并填写采样记录。
实验人员
持证上岗 具有微生物检测 工作经验 熟悉方法标准和 仪器操作 掌握检验技巧
微生物检测操作程序
3.2 设施与环境条件要求
对需要在无菌条件下工作的区域（洁净室），应有明确标识。洁净 室分正压室（100级）和负压室（10000级），常规微生物项目在 100级洁净室检验，致病菌在10000级洁净室生物安全柜检测。
谢谢大家！
⑦固体物品的干燥:开启锅盖，取出被灭菌的物品，冷却后待其自然 干燥。
⑧液体物品的冷却：开启锅盖，取出被灭菌的物品，待其自然冷却， 切不可立即打开瓶塞，否则：由于液体的温度还未下降，而压力蒸汽 突然释放，会使液体剧烈沸腾，造成溢出或容器爆裂。
★注意事项：
①严禁堵塞安全阀出汽孔、手柄透汽孔，必须留有空间，保障其畅 通放汽，否则因安全阀出汽孔、手柄透汽孔堵塞而不能工作，造成 事故。
厌氧培养箱
微生物检测操作程序
3.3 实验结果
实验所用器具在使用前后均应煮沸或高温高压消毒。 消毒后的无菌器具和器皿存放于洁净室内，并标识清楚，超过期限
应重新消毒。 未经消毒的器具存放于前处理室。
细菌总数
细菌的大小与形态
细菌的测量单位： 微米(μm)
细菌的形态
球菌
杆菌
螺形菌
三、霉菌总数