操作规程——半数致死量(LD50)测定

操作规程——半

一、目的

小鼠是应用于流感病毒研究常用的动物模型。半数致死量（LD50）是药物、毒物及病原微生物等毒力水平的一个标志，它表示能使全部实验对象死亡半数的剂量或浓度。由于生物间存在个体差异性，因此LD50需用一批相当数量的实验对象进行实验方能测得，并且每种药物不同实验对象的 LD50值不相同。必须遵循以下原则：1. 剂量必须按等比级数（剂量对数按等级数）分组； 2. 各组动物数应相等； 3. “反应”应大致呈正态分布。最小剂量组的死亡率（Pn）应为 0% ，最大剂量组的死亡率（Pm）应为 100%，如果Pn<20%或Pm>80%需用校正公式计算，如Pn>20%或Pm<80%则不能用此法计算。本操作规程为规范实验操作、保证样本质量、操作安全而制定。中国国家流感中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的规程进行操作。

二、范围

适用于中国国家流感中心所有技术人员进行以小鼠为模型的半数致死量测定。

（一）生物安全要求

根据所使用病毒的生物安全条件在ABSL-2、ABSL-3或ABSL-4条件下操作。病毒融化后不能再次冻存。

（二）材料

根据具体实验配制。

（三）实验步骤

1．预备实验

（1）摸索上下限：即用少量动物逐步摸索出使全部动物死亡的最大剂量（Dm）和一个动物也不死亡的最小剂量（Dn）。方法是据经验或文献定

出一个估计量，观察 2~3 只动物的死亡情况。如全死，则降低剂量；如

全不死，则加大剂量再行摸索，直到找出 Pm =100% 和 Pn =0% 的剂量，此两量分别为上下限。

（2）确定组数，组距及各组剂量

1）组数：一般 5~8 组，可根据适宜的组距确定组数，如先确定5组，若组距过大，可再增加组数以缩小组距。有时也可根据动物死亡情况来决定增减组数。

2）组距：指相邻两组剂量对数之差，常用“d”来表示。d不宜过大，因过大可使标准误增大；也不宜过小，因过小则组数增多，各组间死亡率重叠造成实验动物的浪费。组距大小主要取决于实验动物对被试因素的敏感性。敏感性大者，死亡率随剂量增加（或减少），而增加（或减少）的幅度大，组距可小些；反之，敏感性小者，死亡率随剂量变化的幅度小，则组距应大些。上下限之间的距离可作为敏感性大小的标志。距离大，说明敏感性小；距离小，则说明敏感性大。一般要求d应小于0.155，多在 0.08~0.1 之间。

3）确定组距方法：把上下限的剂量换算成对数值，设上限剂量的对数值为Xk，下限剂量的对数值为X1 ，组数为 G ，则：d＝（Xk-X1）/（G-1）4）确定各组剂量：由 X1 逐次加d（或由Xk逐次减d），得出各组剂量的对数值，再分别查反对数，即得出各组剂量（呈等比级数排列）。

（3）配制等比药液，并使每只动物在给药容量上相等（如 0.5mL/20g）。2．正式实验

（1）实验动物的选择与分组

1）选择原则：可根据不同实验而选取动物，应选择对被试因素敏感的动物。同时也应考虑动物来源，经济价值及操作简便等条件。 LD 50 常用小白鼠进行实验来测得。

2）分组原则：每组动物数必须多于组数。因为每组动物数如少于组数，就不能充分反映各组死亡率的差别。（如共8组，每组 10只动物，高剂量三个组的死亡数分别为6、9、10，但如果每组只用6只动物，则高剂量三个组的死亡数可能都是6）。

3）分组方法：实验对象分组法。首先，按性别将动物雌雄分开或各半混合