类固醇和温度对于性别的决定金钱龟孵公的福音

类固醇和温度对于性别的决定金钱龟孵公的福音(虎四摘录）2010.7.16阅读
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类固醇和温度对于性别的决定雌激素对龟类卵巢发育的早期作用（转载于甲骨文）文章很长，转载于甲骨文爬虫论坛，具体效果有待验证，不过既然有人先走了几步，不管最后成不成功，都应该支持，希望各位都能站在巨人的肩膀上。

另外，转载请说明出处，这是对知识和前辈的尊敬。

想孵公龟快想疯了。

爬文爬到一篇08年的综述。

利用巴西龟作为实验材料，作者阐述了一个决定幼龟性别的模型：孵化温度引起性腺芳香酶（aromatase）的变化，从而进一步影响性腺发育。

翻译过来，希望对想孵化公龟的朋友都有所帮助。

Steroid signaling and temperature-dependent sex determination—Reviewing the evidence for early action of estrogen during ovarian determination in turtles Mary Ramseya and David Crews
Section of Integrative Biology, University of Texas, 2400 Speedway, Austin, TX 78712, United States
Available online 31 October 2008.
Abstract
The developmental processes underlying gonadal differentiation are conserved across vertebrates, but the triggers initiating these trajectories are extremely variable.
The red-eared slider turtle (Trachemys scripta elegans) exhibits
temperature-dependent sex determination (TSD), a system where incubation
temperature during a temperature-sensitive period of development determines offspring sex. However, gonadal sex is sensitive to both temperature and hormones during this period—particularly estrogen. We present a model for temperature-based differences in aromatase expression as a critical step in ovarian determination.
Localized estrogen production facilitates ovarian development while inhibiting male-specific gene expression. At male-producing temperatures aromatase is not upregulated, thereby allowing testis development.
摘要
脊椎动物性腺的发育过程都大同小异，但引发性腺发育的机制却迥异。

红耳龟（Trachemys scripta elegans）是温度决定性别（TSD），也就是孵化过程中，某一阶段（温度敏感时期temperature-sensitive period）的孵化温度可以最终决定幼苗的性别。

其实性腺性别是由孵化温度和激素水平（尤其雌激素estrogen）共同调控的。

我们这里阐述了一个模型：温度影响芳香酶(aromatase，雌激素合成中的一个催化物)表达水平，从而保障了卵巢的(ovarian)发育。

雌激素的分泌促进卵巢发育，同时抑制雄性基因的表达。

在雄性孵化温度（male-producing temperatures）,芳香酶表达水平没有上升，从而保证了睾丸(testis)的发育。

图1
红耳龟性腺发育的过程图。

最下面stage of development是发育阶段。

按照孵化在stage 26发生来计算，一个stage的单位应该是两天。

文章说红耳龟的性腺发育可以分为3个时期，第一个时期bipotential（双向发展）在stage14-16, 28-32天。

由图中可以看到，这也是温度敏感时期的开始，这时候性腺开始发育，但是性别还未决定。

第二个时期Sexual fate determined (性别决定期),stage 16.5/17-19/21,33-40天左右，这时候性腺在不同温度下，可以向不同性别发展，31度性腺发育成卵巢，26度性腺发育成睾丸。

第三个时期sexual differentiation （性别发育期）stage 20/21-hatch，40天左右到孵化，这期间，卵巢睾丸进一步发育成熟阶段。

图2
这张图阐述的文章作者提出的模型。

上面是卵巢(ovary)的发育，下面是睾丸(testis)的发育。

在温度敏感时期开始后，如果是雌性孵化温度（female-producing temperature）雌性的芳香酶(aromatase)表达量增高(图中看大概在34天前后)，促进一大堆雌性相关基因（ERalpha/AR, FoxL2, Rspo1, ERbeta）的表达，最后发育出卵巢。

芳香酶的上调，同时通过ERalpha这个东东抑制一大堆雄性基因(Sox9, Mis, Dmrt1, Sf1)的表达，从而抑制睾丸的形成。

所以根据这个理论模型，34天左右芳香酶的提升，引起一系列变化，从而孵化出雌龟。

图3
提出模型后，开始列数据证明了。

作者测量了不同基因在温度敏感阶段左右的表达水平。

上面一半是卵巢发育。

下面的是睾丸发育。

白色柱表示芳香酶的表达水平。

可以看到雌性这边，stage17之后，芳香酶水平上升明显。

同时雄性这边，芳香酶没有表达。

图4
更具体的数据，显示出芳香酶的上调的确是发生在性腺。

上面A，是性腺里芳香酶的表达水平，虚线是雌性孵化温度下的，stage17之后，显著上升。

实线是雄性孵化温度下的，没变化。

上面B是前列腺，肾脏和性腺的混合样本。

雌性雄性在stage23之前基本重叠，说明芳香酶的上调不是大范围发生的现象。

下面更具体一些。

深蓝色显示的是芳香酶，明显分布在雌性性腺里（CDE）.雄性里没有显著分布(FGH).
图5
温度的变化，可以诱导芳香酶的水平变化。

为了更直观的显示是温度的变化引起芳香酶水平变化的，作者在stage17的时候改变了孵化温度。

光看Arom那两张图就成了。

左边雄性温度提升到雌性温度，芳香酶(深蓝染色)上调；右边雌性温度下降到雄性温度，芳香酶表达下调。

结论
我们建立了一个孵化温度决定性别（TSD）的模型。

在高温下，性腺雌激素产量上升，引发卵巢发育，同时抑制睾丸发育。

随之发育的进行，雌性孵化温度下的高雌激素水平帮助调节卵巢结构的发育成熟。

相反的是，雄性孵化温度下，性腺处雌激素水平受到抑制。

在没有芳香酶的情况下，睾丸基因上调，形成睾丸的发育。

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很简单直接的一篇文章。

不去考虑实验方法上可能的漏洞，如果接受他们提出的这个模型的话，看来芳香酶的水平直接控制幼龟的性别。

自然界是通过温度来调控芳香酶的表达量的，那么人工孵化的条件下，是否可以通过温度和药物两方面来控制呢？查了一下，芳香酶抑制剂是治疗乳腺癌的常用药，比如来曲唑。

相信对于很多想孵公龟的饲养者，不妨用来曲唑试验一下。

在孵化过程中，适当添加来曲唑，抑制芳香酶的合成，从而降低雌激素水平，提高雄性幼龟的孵化率。

至于药物添加的浓度、时间、方式都需要更多的饲养者互通有无，共同解决了。

如何添加来曲唑呢，直接放在蛭石里么
龟之宥01 发表于 2010-7-16 08:45
我们一直知道龟类是通过温度来决定性别问题~具体是温度如何操纵性别的~
我们以前不得而知~
太专业的东西我 ...
愚昧发表于 2010-7-16 08:54
很好的问题，我又搜了搜letrozole(来曲唑)，发现原来很早就有人做过来曲唑改变性别的实验。

实验对象是欧洲泽龟，加药方法是蛋壳上直接滴加。

的确能够在雌性孵化温度下孵化出雄龟！
只不过加药时期对幼龟性腺发育很关键。

如果加药过晚，甚至有孵化时候有睾丸，但是生长一年后能够排卵的情况发生。

具体情况我再查查文献，翻译一下。

比如这篇
Sex reversal and aromatase in the European pond turtle: treatment with letrozole after the thermosensitive period for sex determination.
Belaid B, Richard-Mercier N, Pieau C, Dorizzi M.
Institut Jacques Monod, C.N.R.S. e t Universités Paris 6 et 7, 75251 Paris, France.
Abstract
In the European pond turtle (Emys orbicularis), gonadal sex differentiation is temperature-dependent. The temperature sensitive period (TSP) of gonadogenesis lies between stages 16 and 22 of embryonic development. Previous studies have shown that
embryos incubated at 30 degrees C, a temperature yielding 100% phenotypic females, can be sex reversed by treatments with an aromatase inhibitor administered during TSP or even somewhat after TSP (as of stage 22+). The goal of the present study was to determine whether the ovary still retains male potential at later stages of embryonic development and whether the induced male characters persist after hatching. For this purpose, eggs of E. orbicularis were treated with letrozole, a nonsteroidal aromatase inhibitor, at or as of stages 23, 24 or 25, then gonadal aromatase activity in each individual and the related gonadal structure were studied at hatching (stage 26) and for one year after hatching. Two kinds of treatments were carried out: 1) repeated applications of 10 microg of letrozole in ethanolic solution onto the eggshell and 2) a single injection of 10 microg of letrozole in olive oil. Similar results were obtained with either application or injection of the aromatase inhibitor. In treatments as of or at stage 23, individuals with gonadal aromatase activity lower than 20 fmoles/hour/gonad had ovotestes, i.e., 22% of the treated individuals. At hatching, the inner part of these ovotestes contained testicular cords and also mixed lacunae presenting various degrees of transdifferentiation of the epithelium into a Sertolian epithelium. The cortex was maintained, although some germ cells degenerated within it. These processes continued after hatching. However, at 12 months, gonads were still ovotestes displaying some follicles with a growing oocyte in the remaining parts of the cortex. In treatments as of or at stages 24 or 25, only a few individuals were masculinized. One had ovotestes in others, the cortex was absent in some parts and when it was present oocytes were degenerating. These results show that in the European pond turtle, differentiation of ovotestes from ovaries can be induced by treatment with an aromatase inhibitor starting at late stages of embryonic development (between the end of TSP and hatching), although such differentiation is less frequent as embryonic development proceeds. Sex reversal persists for at least one year after hatching.
仔细找了找，其实一共也没有几篇文章。

来曲唑的确在很多动物发育中都有促进雄性发育的功效。

关于龟类中的效果，好像主要是法国巴黎大学的Mireille Dorizzi的研究组在90年代后期做的比较多。

得出的结论基本就是在温度敏感期（temperature-sensitive period）开始时，添加来曲唑，即便在雌性孵化温度下，幼龟的性腺仍有雄性特征。

具体结论如下：
1.加药时间在Stage15.TSP开始前。

由于孵化时间在60-120天不等。

所以这个所谓的stage15还是很不好拿捏的。

由于出壳期统一定在stage 26，所以stage 15大概是孵化中间靠后的时候。

当然不同种龟，这个时间又飘忽不定了。

不过晚加不如早加效果明显，所以可以尝试在孵化一个月后开始加药。

2.加药方法两种：10微克来曲唑溶解在10微升酒精中，直接滴加到蛋皮上。

连续添加4次，每两天一次。

每次滴加的位置都不同，以便达到最大效果；另一种方法比较恐怖。

10微克来曲唑溶解在50微升橄榄油中，直接注射到蛋内，一次即可。

相信很多人都会选择第一种方法。

3.来曲唑处理过的龟卵，即便在雌性孵化温度也有很高比例的雄龟孵化。

这里有个问题，就是如何判定幼龟的性别。

作者是通过解剖幼龟，染色，然后观察器官的性状。

有睾丸，输精管结构的，并且卵巢结构退化的，就称为雄性特征的幼龟。

但具体具有这样结构的龟，长大以后，是否真正能具有雄性的功能，原文没有做这方面的调查。

情有可原，有点数据都着急发文章，不可能等个5-6年，看公苗最后到底能不能当爸爸。

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上个世纪末的研究成果，相信国内龟场的养殖户不可能不知道。

应该很多人都尝试到自家繁殖的三线蛋上了吧？不知道效果如何。

如果这个方法的确行之有效，且孵化的雄苗日后雄性功能健全的话。

相信对很多种雄少雌多的珍贵龟种都是一个好消息。