细胞悬浮培养

培养基的振荡
首先，它可对细胞团施加一种缓和的压力使它 们破碎成小细胞团和单细胞；
其次，振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保 持均匀的分布。
此外，培养基的运动还会促进培养基和容器内空气之 间的气体交换。
在悬浮培养中，为了使培养基能不停地运动，可以 使用各种类型的设计。
(1)旋转培养 (2)往返震荡培养 (3)旋转震荡培养 (4)搅动培养
提高细胞分散程度的方法
1. 尽可能使用易散碎的愈伤组织 愈伤组织的结构是受遗传因子控制的，因而
有时无论采用什么办法也难于使细胞充分分散。 不过，一般来说，如果培养基的成分和继代方法 选用得当，总有可能提高细胞的分散程度。
如果把愈伤组织在半固体培养基上保存2-3个继代周期， 其松散性常会增加。
2. 加入特殊物质（较少细胞之间的联系、减慢细胞分裂
③全部细胞通过细胞周期中某一点所需的总时间占 细胞周期时间长度的百分数。
悬浮培养细胞同步化的方法有两类：
物理方法和化学方法。
物理方法主要是通过对细胞物理特性（细胞或小细 胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等）的 控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小 进行选择的方法和低温休克法等。
化学方法的原理是使细胞遭受某种营养饥饿，或 是通过加人某种生化抑制剂阻止细胞完成其分裂 周期。化学方法中常用的有饥饿法和抑制法两种。
旋转培养器
液晶屏双层震荡培养器
磁力搅拌培养器
5.3 悬浮培养细胞的同步化
同步培养是指在培养中大多数细胞都能同时通过 细胞周期的各个阶段(G1，S，G2和M)。同步性程度 以同步百分数表示。
确定同步性的参数 ①在某一时刻处于细胞周期某一点上的细胞的百 分数；
②在一个短暂的具体时间内通过细胞周期中某一 点的细胞的百分数；
（一）饥饿法
在这种方法中，先对细胞断绝供应一种进行 细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞 在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重 新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就 会同步进入分裂。
（二）抑制法
使用DNA合成抑制剂如5-氨基尿嘧啶、羟基脲和 胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当 细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能 进行到G1期为止，细胞都滞留在G1期和S期的边界 上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分 裂。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细 胞周期。
悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来 之后，又被放回到培养系统中。
随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。
开放型连续培养的特点
注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液 及其中细胞的容积相等。
培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的 恒定水平上（通过调节流入和流出的速度） 。
开放型培养又可分为两种主要方式： （控制生长速度的方法）
在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注 射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细 胞和小细胞团（(2-4个细胞），而不能通过大的 细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒，以 便让大的细胞团沉降下去，然后再由上层吸取悬 浮液。
但是必须记住，即使在分散程度最好的悬浮液 中也存在着细胞团，每个细胞团由几个或几十 个细胞组成，只含有游离细胞的悬浮液是没有 的。这是因为植物细胞具有集聚在一起的特性， 由一个初始细胞经过分裂产生的若干个子细胞， 不能像子代细菌那样各自分散在培养液中。
是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定容 积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培 养物。
分批培养的特点
在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可 以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养 基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长 即行停止。
分批培养所用的容器
一般是100～250 ml三角瓶， 每瓶中装有20～75 ml培养 基。
（二）连续培养（continuous culture）
指在培养Βιβλιοθήκη Baidu程中，不断注入新鲜培养基，排
掉用过的培养基，保持培养物的容积恒定，使培养 液中的营养物质得到不断补充。
连续培养图示：
加入培养基
排出培养基及其培养物
连续培养的类型
封闭型 开放型
封闭型连续培养的特点
排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充， 进出数量保持平衡。
5 细胞悬浮培养
细胞悬浮培养（cell suspension culture）
是指将游离的单细胞或细胞团按照一定的细 胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。
这种培养方法能提供同步分裂的、增殖迅速的大 量细胞，可用于大规模的工业化生产。
5.1悬浮培养的方法
分批培养 连续培养
（一）分批培养(batch culture)
另外，如果缩短两次继代的时间间隔，例如， 每2～3d即继代一次，则可使悬浮培养的细胞一 直保持对数生长。
据报道，加入条件培养基（即在其中曾培养过一 段时间植物组织的培养基）可以显著缩短滞后期 的长度。
如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太 长，则会引起细胞的大量死亡和解体。因此，当 细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入 静止期的时候，须尽快进行继代。
一是化学恒定式； 二是浊度恒定式。
5.2 细胞悬浮培养的培养基
能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培 养基，一般来说也同样适用于建立该物种的悬浮 培养，只是琼脂当然要从中去掉。
条件培养基的使用方法
条件培养基是在其中曾培养过一段时间植物组 织的培养基。
简便方法是把在液体培养基中培养了4～6周的 高密度细胞滤掉，而用它的培养基制成悬滴或薄层 来培养单细胞或低密度细胞群体。
的速度）
已知加入2, 4-D，少量水解酶（如纤维 素酶和果胶酶），或加入酵母浸出液一类的 物质，都能促进细胞的分散。
3.加新鲜培养基
如果每隔1d加一次新鲜培养基，使生物量 与培养基容积之比保持为2，这样，悬浮培养 细胞即可长期保持在对数生长晚期，于是就有 可能使细胞最大程度分散。
4.选择单细胞和小细胞团进行继代
为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方 法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜 培养基中（大约稀释5倍）。
滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细 胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长， 而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。
如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞 或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能 生长。