荧光测定黄酮

基于荧光光谱法对银杏黄酮糖苷的检测研究1

温宗壮

中国矿业大学化工学院生物工程11-2

摘要：银杏黄酮糖苷因具有多种生物活性而被制药、食品、日用品等诸多领域广泛应用。针对目前银杏黄酮糖苷检测操作繁琐、成本高、耗时长的不足，建立了一种高精确性、低成本的快速测定方法。根据黄酮类化合物能与Al3+反应形成荧光螯合物的原理，以芦丁为标样探索测试条件，结果表明在激发波长λ

ex

=400 nm，

发射波长λ

em =520 nm，pH为3.6 的Al（NO

3

）

3

-（HAc-NaAc）反应体系中反应

1500 s，螯合物荧光强度趋于稳定且达到最大值。求得芦丁浓度与荧光值的线性回归方程为y=29.92x+36.49（R2=0.986），线性范围为 1.8×10-6～3.2×10-5 mol/L。用这种方法检测了银杏悬浮培养细胞中黄酮糖苷的含量，并进行加标回收实验，平均回收率为101.3%。该方法灵敏度高，重现性好，操作简单，具有良好的应用前景。

关键词：荧光光谱法银杏黄酮糖苷

引言

银杏黄酮具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤等诸多作用，是生物制药、保健食品、功能性产品、化妆品和动物饲料添加剂等诸多行业产品开发的主要原料[1]。紫外可见分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry, UV）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）等方法是常用于检测植物中黄酮类化合物的手段。其中UV法是最传统、应用最广泛的方法。Zhu等利用紫外可见分光光度法对5种提取马齿苋黄酮方法的结果进行了检测[2]。Wang等也在刺五加上用同样的方法做过类似的研究[3]。但是该种方法用于测定植物中未经纯化的黄酮粗提物，结果会很大程度上受到杂质的干扰，这已经成为不争的事实。其原因在于许多提取物中常见的杂质如咖啡酸和鞣质也具有邻苯二羟基结构，也能参与Al3+的显色反应，使得测定结果会比实际值偏高。HPLC法测定结果相对准确，但设备昂贵、仪器维护成本高、使用费时且测定各成分时需要标准品对照，

使用成本也高，实力一般的科研机构难以接受，通常为了得到更为精确的组分信息，经常与质谱（mass spectrum, MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）等手段连用，进行定性定量检测。Qing等利用HPLC-MS结合13CNMR 法从月季中鉴定了4个黄酮糖苷[4]。Anja[5]、Zhao[6]、Chang[7]等都从不同的生物样本中分离鉴定了多种黄酮类化合物。毛细管电泳法在分析植物次生代谢物方面也有许多报道。在检测银杏黄酮组分中也已经有了应用。Zhang等用毛细管电泳法检测了菊花黄酮，建立了浓度与电流响应的线性关系[8]。Chi等利用毛细管区带电泳分离检测了中国凉茶中几种黄酮物质，这种方法能高效分离、省时、所需样品少、重现性好[9]。但其具有HPLC法一样的缺点。此外气相色谱法在黄酮类化合物的分析中应用很少，这主要是由于黄酮类化合物不耐受高温，检测前需利用衍生化试剂将其衍生化，增加了实验成本，操作复杂，不被广泛采用。

根据黄酮类化合物能与Al3+反应形成荧光螯合物的原理，本文建立了以芦丁为标品的银杏黄酮糖苷荧光光谱法（Fluoro-spectrophotometry method，FSM）的检测手段。Serbia等曾研究了荧光分光光度法对人血清桑色素的检测，以液相色谱法的检测结果为对照，表明两种方法的相对标准误差在可接受范围内，荧光分光光度法是可靠的[10]。本试验中以银杏悬浮培养细胞为样品提取黄酮糖苷并测定其含量，为植物药的开发利用提供了有力保障。

1 实验部分

1.1试验材料与试剂

银杏细胞为本实验室培养所得，烘干并碾成粉末，贮存于干燥器中暗处保存备用。氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇、芦丁均为分析纯及色谱级甲醇产自国药集团化学试剂有限公司。槲皮素、山萘素和异鼠李素标准品（纯度≥98%）购于成都曼斯特生物科技有限公司，配制成0.05 mg/mL备用。去离子水。

1.2仪器设备

荧光分光光度计为日本Hitachi公司生产的FL-2700型号；高效液相色谱仪为戴安中国有限公司生产的Dionex P680型，反相C18柱250×4.6mm。

1.3 标样及样品的制备

精确称取芦丁标样0.01 g，色谱级甲醇溶解，定容至100 mL，得到0.1 mg/mL 的标准溶液。取标准溶液1、2、3、4和5mL，各加入10%的Al(NO3)3及2.5 mL 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用纯甲醇定容至25 mL。精确称取烘干的银杏愈伤组

织和样品1 g，按固液比1:9加入甲醇，500 W超声波辅助萃取50 min后滤纸过滤，取试样加10%的Al(NO3)3溶液及2.5 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用甲醇定容。

1.4测试条件

荧光分光光度法测定中激发光谱通带和发射光谱通带均设定为5 nm，激发电压700 V，此条件下,扫描最佳激发波长和发射波长，考察铝离子添加量、缓冲液pH、甲醇浓度、反应时间对荧光强度的影响。并在所得的最佳色谱条件下测定各浓度标准溶液的荧光强度，建立回归方程。在相同条件下测定悬浮培养细胞黄酮提取液的荧光强度，根据回归方程计算含量。黄酮糖苷水解及HPLC法测试条件参照Chen等的方法［11］。

1.5 数据处理

所有实验数据利用软件Origin pro 8.0处理。

2 结果与讨论

2.1 最佳激发波长与发射波长的确定

对芦丁标准品进行激发波长和发射波长扫描，如图1所示当荧光强度最大时，激发波长λex=400 nm，发射波长λem=520 nm，所以选择激发波长λex=400nm，发射波长λem=520nm检测黄酮。

图片1 激发波长和发射波长下的扫描

2.2 Al(NO

3

)

3

的添加量

考察了10% Al（NO3）3添加量分别为0、1、2、3、4、5和6 mL与黄酮形成的螯合物荧光强度的影响。光谱图如下2所示：

I

n

t

e

n

s

i

t

y

λ/nm

I

n

t

e

n

s

i

t

y

λ/nm 550

600

650

700

750

800

a

I

n

t

e

n

s

i

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y

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