SSR分子标记的开发技术研究进展

文章编号:1001-4829(2002)04-0106-04

收稿日期:2002-09-23

作者简介:唐荣华(1965-),男,广西人,副研究员,在职博士生。主要从事生物工程及经济作物研究。

SSR 分子标记的开发技术研究进展

唐荣华1,张君诚2,吴为人2

(11广西农业科学院经济作物研究所,广西南宁　530007;21福建农林大学作物科学学院,福建福州　350002)

摘　要:综述简单重复序列标记(SSR )的特点及在作物遗传图谱构建、品种鉴定及分子标记辅助育种等方面的应用价值。重点描述开发SSR 标记的两种方法的基本原理和主要步骤,一种是通过克隆酶切片段和大量测序寻找SSR 标记的传统方法,一种是应用

SA GE 原理不需要克隆的STMP 技术。介绍这两种方法在创建小麦或大豆SSR 标记中的应用。它们都能有效地开发可扩增出特

定位点SSR 的PCR 引物。关键词:SSR ;分子标记;引物开发中图分类号:S188　文献标识码:A

Progress in the w ay to develop SSR molecular marker

TAN G Rong 2hua 1,ZHAN G J un 2cheng 2,WU Wei 2ren 2

(1.Research Institute of Cash Crops ,Guangxi Academy of Agricultural Sciences ,Nanning Guangxi 530007,China ;2.College of Crop

Science ,Fujian Agriculture &Forestry University ,Fuzhou Fujian 350102,China )

Abstract :The characteristics of simple sequence repeats (SSR )and its importance in genetic mapping ,variety identifying and molecular marker 2assistant breeding ,etc ,are discussed in this article.And two ways which can develop SSR molecular markers with their basic princi 2ples and main steps are also shown in this article.One is the traditional way which needs a great number of cloning of enzyme 2cut DNA fragments and a great deal of sequencing ,the another is a new way which can eliminate the cloning step and can reduce much more work of sequencing by the basic principle of serial analysis of gene expression (SA GE ).The utility of these two ways in the development of bread wheat or soybean SSR is shown.The results showed that they were effective in the designing of PCR primers to amplify locus 2specific SSR.

K ey w ords :SSR ;molecular marker ;primer development

所有真核基因组中均含有一类DNA 碱基序

列,被称为微卫星(L ITT and L U T Y1989)[1]或简单重复序列(SSRs )(TAU TZ et al.1986)[2],它们均由1～6个碱基组成的基本序列串连而成,不同等位基

因间的重复数存在丰富的差异,因而是许多真核基

因组中普遍存在的遗传标记来源(WAN G et al.1994)[3]。微卫星分析的主要技术是聚合酶链式反应(PCR ),比之限制性片段长度多态性(RFL P )分析容易得多,而且易于分析自动化。在植物当中,微卫星已被证明在很多物种中是高信息量的,并且是位点特异的分子标记(C ONDIT and HUBBE LL 1991,PROV AN et al.1996,SMULDERS et al.1997)[4～6]。由于

微卫星可在多个等位基因间显示差异,因而在作物的遗传图谱构建,遗传多样性发析,亲缘关系鉴定,DNA 指纹图谱构建,品种鉴定,Q TL 分析及分子辅助育种中均具有公认的优越性及应用前景。这一分子标记的特殊性及重要性在于其有以下特征:①均匀,随机,广泛地分布于水稻、大麦、小麦、大豆等多种作物基因组中。②SSR 序列的两侧顺序常较保守,在等位基因间多相同。③多数SSR 无功能作用,增加或减少几个重复序列的重复数不影响生物的正常生长发育,因而在品种间具广泛位点变异,比RFL P 及RAPD 分子标记更具多态性,尤其对花生、六倍体小麦等用常见分子标记技术检测不出很多DNA 片段多态性的作物品种来说,具有更大的研究价值和应用前景。④呈孟德尔式遗传,共显性,因而对个体鉴定具特殊意义。⑤仅需微量组织,即便DNA 降解,也能有效地分析鉴定。⑥虽然开始筛选

601西　南　农　业　学　报

Southwest China Journal of Agricultural Sciences

2002年15卷4期

Vol 115 No 14

重复序列和引物设计过程较慢,但只要确定了引物,结果稳定。

SSR分子标记的开发就是检测出SSR两侧的核苷酸序列作为设计PCR扩增引物的根据,以便在不同品种或不同个体间扩增出多态性SSR DNA片段。本文重点介绍创建SSR标记的常规技术和一种新的改良技术,并以面包小麦为例介绍其应用效果,对其应用前景作一分析。

1　常规SSR分子标记开发技术

111　基因组文库的构建

对提取的基因组DNA进行酶切。酶切一般用两种限制性内切酶,一种是识别位点为6个碱基,如EcoRI(G/AATTC),BamHI(G/G ATCC)或者Rst I(CT2 G CA/G),其中Pst I是一种对CN G甲基化敏感的酶,如果识别位点的胞嘧啶被甲基化,则不能切割,可用于特异切割有转录活性的DNA区域;另一种的识别位点为4个碱基,如MboI(/G ATC),Sau3A(/G ATC)。由于酶切位点较识别位点为6个碱基的内切酶多,因而可得到较小的DNA片段。酶切后的片段在1%琼脂凝胶电泳分离。切下大小为2～5kb或更小的片段,用G enecleanⅡ(Bio101Inc)试剂盒纯化。纯化的片段连接到λ载体如Lambda Z apⅡ(Stratagene,La Jolla, CA),Bluescript(Stratagene)等载体上,转化大肠杆菌,如X L22Blue菌株,将转化后的大肠杆菌涂布于含青霉素(100mg/L),X2gal(40μg/L),IPTG(400mg/L)的LB选择培养基上,以便判断连接,转化效果及对克隆的选择。

112　带有微卫星克隆的识别和筛选

人工合成带放射性同位素或化学发光物质标记的与SSR互补的探针,然后与文库中各个克隆的DNA杂交,鉴定出含有SSR的克隆。需要2～3次重复鉴定以确定目的文库。

113　测序

筛选出的带SSR序列克隆在作序列分析之前进行预处理:将单个克隆经12h(37℃)液体LB摇动培养后,用Q IAwell Plasmid K it(Qiagen Inc.)分离和提取带插入序列质粒,用作序列分析。序列分析采用AB I d Rhodamine sequencing kit,先作PCR 反应,经沉淀及变性后在自动的激光荧光DNA测序仪(Pharmacia)上测序。

114　引物设计

目前多数使用PRIM ER015计算机软件(Whitehead Institute,Camridage,MA02142)选择引物,主要参数因不同作物和SSR类型而异。一般为:引物长度18～30bp,产物的长度为80～300bp,PCR反应的退火温度为40～60℃。引物3’端有1～2G/C核苷酸,单个引物少于3个核苷酸的互补,两个引物之间少于连续3个核苷酸的配对,以防止PCR时引物形成二聚物及发夹结构而影响扩增物的产量。

115　检测

所设计的引物必须经过PCR在对应克隆和基因组DNA中扩增出预计产物才能成为可用的SSR 标记引物。剔除那些两个反应产物片段大小不一致,或非期望片段大小,或有多个片段的引物。

Marion S.R der等[7]利用该技术从含有A、B、D三个染色体组的六倍体面包小麦基因组中开发出230对微卫星引物,可扩增出279个微卫星。大多数引物对都是基因组特异的,并在三个染色体组之一中只扩增出一个微卫星,只有20%的标记可检测到一个以上的位点。并把93个位点定位到A染色体,115个定位到B染色体组,71个定位到D染色体组。这些标记在连锁图上是随机分布的,但在几个着丝点区域有聚集现象。小麦微卫星的二核苷酸主要重复单位有A G,CA,TA,TC,GT。在大豆中已开发出900多个SSR标记,约700个SSR标记的引物选择设计在(A TT)n两侧,约200个SSR标记的引物选择设计在(CT)n两侧,约30个SSR标记的引物选择设计在(A T)n及其它类型两侧。

由于要建基因组文库,并需要对每个克隆进行SSR筛选和鉴定,工作量非常大,找到一个有功能的SSR需要花费大量的人力物力,也需要花费大量的时间,影响了该方法的推广普及。

2　序列标签微卫星整合技术

如果在SSR开发过程中省去基因组文库的构建和克隆的筛选,并能在每个克隆质粒的一次测序中获得多个SSR位点的信息,那将会节省大量的费用和时间。M.J.Hayden and P.J.Sharp采用一种新的分子生物学技术———基因表达系列分析(SA GE)原理,构建序列标签文库,用于在目的基因组内进行SSR位点的快速鉴定,从中可开发出微卫星标记。基本原理和具体步骤如下:

(1)基因组DNA酶切:用两种限制性内切酶(如MseI和Pst I)酶切,产生带粘性末端的DNA片段。

(2)连接接头:用T4DNA连接酶把MseI和Pst I两种接头分别连接到所获得的DNA片段上,用QiaQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化连接上接头的DNA片段,并用核酸外切酶Ⅲ处理,降解掉接头未完全接好的DNA片段。

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4期唐荣华等:SSR分子标记的开发技术研究进展