肠球菌检测

报告结果
肠球菌种水平的鉴定
生化鉴定
菌种 粪肠球菌 屎肠球菌 鸟肠球菌
生化特性
不分解L-阿拉伯糖，分 解山梨醇；
分解L-阿拉伯糖，不分 解山梨醇；
分解L-阿拉伯糖，分解 山梨醇；
分子鉴定
菌种 粪肠球菌 屎肠球菌
引物序列
5’-ATCAAGTACAGTTAGTCTTTATTAG-3’ 5’-ACGATTCAAAGCTAACTGAATCAGT-3’
杆菌）
产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌
青贮饲料、牛
饲料
副干酪乳杆菌
青贮饲料
凝结芽孢杆菌
肉鸡、生长育 肥猪和水产养 殖动物
在欧盟批准的微生物添加剂中近1/3含有屎肠球菌。
肠球菌：我们的朋友OR敌ห้องสมุดไป่ตู้？
朋友
肠球菌是人或动物消化道的正 常菌群之一，乳酸菌的一种。 有实验表明，肠球菌制剂在提 高幼年畜禽体增重、提高动物 免疫力、调节肠道微生态平衡 ，提高营养吸收、减少腹泻率 、降低死亡率等方面均有很好
引物：P1:5’-TACTGACAAACCATTCATGATG-3’ P2: 5’-AATTCGTCACCAACGCGAAC-3’
试剂 PCR Mix
P1 P2 ddH2O DNA 总体积
使用量（μL） 25 2 2 16 5 50
生化鉴定
PCR鉴定
95℃预变性5 min后，按照95 ℃ 30 S ， 55 ℃ 30 S， 72 ℃ 30 S进行30个循环；然后72 ℃延伸5 min，4 ℃ 保存。
➢ 产品质量良莠不齐，部分生产企业在菌种纯化、生产工艺及杂菌污染 控制方面较为欠缺。
➢ 加强微生态制剂的安全评价工作，从而使产品质量处于受控状态下。 ➢ 与企业加强合作，开展污染源追溯调查，为实际生产应用提供指导。
请各位专家批评指正！
河南省兽药饲料监察所
的效果。
VS
敌人
条件致病菌，是院内感染的重 要病原菌，不仅可引起人体尿 路感染、皮肤软组织感染，还 可导致菌血症、心内膜炎、脑
膜炎等严重感染。
饲料添加剂品种目录（2013）
中华人民共和国农业部公告第2045号
类别 微生物
通用名称
适用范围
地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、
屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德式乳
肠球菌的检验方法
2018年5月8日
河南省兽药饲料监察所
汇报内容
一、肠球菌概况 二、肠球菌检验方法 三、下一步工作建议及打算
肠球菌概况
原属于链球菌属D群，具有D抗原； 1984年命名为肠球菌属； 主要有19种，5个群； 是人类、动物肠道的正常菌群 最常见为粪肠球菌引起的感染、今年屎肠球菌引起
的感染也越来越多见。
选择性琼脂培养基比较
肠球菌琼脂
肠球菌琼脂
mEI 琼脂
肠球菌快速定性检验方法
称取样品25g
接种于BPW增菌肉汤中
36±1℃ 16-24h 取1mL BPW增菌液转接于9mL肠球菌增菌肉汤种
36±1℃ 20-24h
挑取一环划线接种于KF链球菌琼脂培养基 36±1℃ 40-48h
挑取可疑菌落划线接种于脑心浸液琼脂 36±1℃ 40-48h
无 45℃BHIB 生长实验。
增加了 Vitek或API
菌落计数及计 算。
检验用培养基的特性
肠球菌肉汤、肠球菌琼脂和胆汁七叶苷琼脂：培养基的胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁 中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌能在胆汁中生长，并水解七 叶苷，使培养基变黑。
叠氮化钠葡萄糖肉汤：叠氮化钠可以抑制革兰氏阴性菌生长。 KF链球菌琼脂：叠氮化钠可以抑制革兰氏阴性菌生长，溴甲酚紫为指示剂染料，肠球菌能将氯化三
杆菌乳酸亚种（原名：乳酸乳杆菌）、植物乳杆菌、乳酸片
球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单
胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧 养殖动物
杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、
米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、
发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种（原名：保加利亚乳
的效果。
VS
敌人
条件致病菌，是院内感染的重 要病原菌，不仅可引起人体尿 路感染、皮肤软组织感染，还 可导致菌血症、心内膜炎、脑
膜炎等严重感染。
临床症状
最常见的医院感染病原菌； 尿路感染； 腹膜炎、盆腔炎、胆囊炎； 菌血症。
在需氧革兰阳性球菌中，肠球菌是仅次于葡萄球菌的重要院内感染致病菌。美国医院感 染监视系统(NISS)已将其列为引起医院感染的第二大病原菌。
耐盐性
耐高盐 （6.5%NaCl）
耐酸碱性
PH 9.6
鞭毛
部分有稀疏鞭毛
触酶试验
阴性
革兰氏染色 菌落形态
阳性
灰白色、不透明、表面 光滑、直径0.5-1mm圆
形菌落
氧化酶
阴性
耐药性
固有耐药、获得耐 药、耐受性
可在胆汁七叶苷和含6.5%NaCl培养基上 生长
代谢特性
可发酵的碳水化合 物范围广泛，可发 酵乳糖。产酸，不 产气。很少能够还
5‘-AGTTCATGTCTATTTTCTTCAC-3’ 5‘-CTTCATTATTTACACGTTTG-3’
hly与esp基因检测电泳图
存在的问题及下一步工作打算
➢ 菌种是微生物生产企业的第一要素。农业部对饲料添加剂中允许使用 的微生物种类有明确规定。但目前对产品没有统一的质量标准，对产 品安全性缺乏评价机制。
肠球菌的分布
肠球菌是人和动物肠道中的正常菌群，可以从多种自然环 境中分离，包括土壤、粪便、水、植物、人体、动物等。
蜡样芽胞杆菌生物学特性
形态性状
镜检形态
成双或短链状排列的球 菌，卵圆形
大小
0.6-2.0μm×0.6-2.5μm
芽孢
无
荚膜
无
生长特性
营养类型
化能异养、营养需 求高
需/厌氧
需养及兼性厌氧
肠球菌的检验方法
标准
适用范围
选择性增菌
制样
选择性培养基 接种和培养 确证试验 结果报告
SN1933.1: 平 板计数法
MPN法
检验未经加工 处理的生鲜食 品及肠球菌数
大于 10CFU/g(mL)
的水和食品
污染程度低、 受损伤的肠球 菌加工食品、 肠球菌数小于
等于 10CFU/g(mL)
的水和食品
25 mL(g)样品 +225 BPW 如需要:10倍 梯度稀释；污 叠氮化钠葡萄 染程度低样品 糖肉汤（阳性： 可直接检验。 混浊）或肠球 菌肉汤（阳性： 变黑）。
菌落生长速 度 快
慢
菌落大小 小 小
菌落易辨识 度
有底色，难 辨识
培养及配置 易
易辨识
较易
快
大
易辨识
难
肠球菌检验用培养基
肠球菌肉汤
左：阳性管 右：阴性管
叠氮化钠葡萄糖肉汤
左：阳性管 右：阴性管
肠球菌肉汤和叠氮化钠葡萄糖肉汤增菌效果比较
肠球菌肉汤和叠氮化钠葡萄糖肉汤的选择性增菌效果比较 左：肠球菌肉汤 右：叠氮化钠葡萄糖肉汤
近年来，肠球菌耐药性和耐药基因的传播一直是人们关注的主要问题，特别是万古霉素 耐药肠球菌（VRE）的出现打破了“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”。
2012年欧盟禁止粪肠球菌在人与动物益生菌中使用。
欧盟屎肠球菌安全性评估准则
欧洲食品安全局动物饲料添加剂和饲料产品委员会（FEEDAP）的微生物工作小组建立 了屎肠球菌安全性评估准则，并制定了一份便于申请人参考的指导性文件。
5’-ATGAAAGAAACAAAGATCAA-3’ 5’-TTAACTTTTGATAATTTGCTC-3’
5’-GGTCACAAAGCCCAACTTGT-3’ 5’-ACGTCGAAAGTTCGATTTCC-3’
5‘-GATGGGACAGATGGAAAC-3’ 5‘-GAAACTAGCGATGTAGGG-3’
原硝酸盐
其他特性
通常为Lancefield 血清D群
GC含量37-45%
肠球菌：我们的朋友OR敌人？
朋友
肠球菌是人或动物消化道的正 常菌群之一，乳酸菌的一种。 有实验表明，肠球菌制剂在提 高幼年畜禽体增重、提高动物 免疫力、调节肠道微生态平衡 ，提高营养吸收、减少腹泻率 、降低死亡率等方面均有很好
滤膜法
生活用水、生 产加工用水、 废水及茶饮料、 碳酸饮料等液 体饮料中肠球 菌的检验。
加样量在1100mL之间按 半对数间距选 择。
吉林省 地方标准：平
板计数、 MPN法、滤
膜法
同SN的平板 计数、MPN 法和滤膜法
同SN的MPN 法
同SN的平板 计数、MPN 法。
mEI琼脂：带蓝 色晕圈的菌落。 培养温度：42℃
培养。
同SN的平板计数 和MPN法。滤 膜法使用KF链球 菌琼脂和肠球菌
琼脂。
样品过滤。
菌落计数及计
1、
算。
BEA平板上
生长并水解
七叶苷；
2、
6.5%NaCl MPN值法报
的BHIB生长； 告肠球菌数。
3、
45℃BHIB
生长。
4、
镜检为革兰
氏阳性球菌。 菌落计数及计
算。
同SN的平板 计数、MPN 法和滤膜法。
苯基四氮唑还原成一种酸性的偶氮染料，显示为紫红色菌落。 mEI琼脂：肠球菌能水解七叶苷；叠氮化钠可以抑制革兰氏阴性菌生长；放线菌酮抑制真菌；肠球菌
能将氯化三苯基四氮唑还原成一种酸性的偶氮染料。萘啶酮酸抑制革兰氏阴性菌生长。
三种选择性培养基的比较
肠球菌琼脂
KF链球菌琼 脂
mEl琼脂
选择性 高 高 高
区分的关键在于对氨苄青霉素是否敏感以及是否含有临床分离菌株所含的3个遗传标志 物。
FEEDAP认为，当屎肠球菌菌株对氨苄青霉素的抗性大于2 mg/L或含有上述3个遗传标 志物任意其一时，均不得作为饲料添加剂使用。
3个遗传标志物 IS16（可动因子，医院分离菌株标志物） Esp（屎肠球菌表面蛋白，致病岛标志物） hyl基因（屎肠球菌透明质酸酶）
5’-TTGAGGCAGACCAGATTGACG-3’ 5’-TATGACAGCGACTCCGATTCC-3’
抗氨苄西林（Ampicllin）试验
MIC 1.5mg/L
MIC 2.0mg/L
MIC 2.5mg/L
ABC
ABC
ABC
肠球菌致病基因的检测
基因 hly ESP cylA gelE
引物序列