遗传学实验

实验步骤
1、先用清水漱口。然后用舌头舔颊粘膜上颚、用牙 刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾 液吐到杯中。用1ml生理盐水洗涤，后将1.5ml液 体转入1个干净的EP管中，2000rpm离心5分钟， 倒掉上清。 2、重复用1.0ml生理盐水洗涤沉淀1次，离心，去上 清。 3、沉淀中加500μl 1x细胞裂解液（STE），打散细胞 团、混匀，再加15μl 20mg/ml蛋白酶K，充分混 匀。 55℃水浴30min。
5条(可见3条) 4 片 有、位于前足附节上
（二）果蝇的培养及杂交
1、果蝇培养时常用的培养基
2、果蝇的麻醉 首先，将培养瓶棉塞上的果蝇驱到瓶底，打开 培养瓶与麻醉瓶的瓶塞，迅速使两瓶口对接， 将培养瓶中部分果蝇驱入麻醉瓶中，迅速塞上 棉塞，防止果蝇的种群污染，拔开麻醉瓶棉塞， 以其侧面遮盖麻醉瓶口，再棉塞中央滴几滴乙 醚，塞上棉塞，等果蝇麻醉。（果蝇翅膀外层 45度角表死亡）
4、加500μl饱和酚，轻摇混匀，室温12000rpm离 心10min。 5、上清（注意不要吸到中间层白色絮状物质以及 下层有机相）移至另一加入装有500μl氯仿的EP 管，轻摇混匀，室温12000rpm离心10min。 6、吸取400μl上清（注意不要吸到中间层白色絮状 物质以及下层有机相）至已装有900 μl预冷无水 乙醇的离心管，混合均匀，可见白色絮状沉淀， 10000rpm离心5min，DNA沉淀在管底。 7 、 去 上 清 ， 加 入 70% 乙 醇 1ml 清 洗 沉 淀 ， 10000rpm离心5min，去上清（尽量用小枪头 将液体去干净，但注意不要将沉淀也吸走）， 室温干燥5min，再用50μl TE buffer溶解沉淀， 4℃储藏备用。

a 正常红细胞
b正常细胞核均等分裂
c正常细胞的均等分裂
d 核变形
e 核变形
泥鳅血红细胞的血涂片图-1
f 核不均等缢缩
g 微核
h 微核
i细胞不均等分裂
j 细胞不均等分裂
k 细胞开始凋亡
泥鳅血红细胞的血涂片图-2
l细胞裂解
作业
蚕豆：每一处理至少观察3个根尖，每个根尖数1000 个细胞，计算微核数、污染指数，判断污染程度。 泥鳅：每处理3个重复，每重复统计1000个细胞 ，计 算微核数、污染指数，判断污染程度。 微核率= 微核细胞数／观察细胞总数 × 1000 ‰ 污染指数（PI）=样品实测MCN‰平均值/对照组MCN‰平 均值
遗传学实验
1.果蝇的培养、形态观察及整体装片的制作 2.果蝇的伴性遗传 3.果蝇巨染色体的制片和观察 4.从口腔脱落细胞中提取人类基因组DNA 5.PCR法鉴定人SRY基因 6.学生自主创新性实验——微核检测技术 7.荧光定量PCR检测烟草刺激后人肺细胞 ERCC4基因和GAPDH基因的表达变化 8.人类ACE基因多态检测及其与耐力运动能 力的关联分析
X2检验（ F2）
实验三 果蝇巨染色体的制片与观察
一 实验目的
1、练习果蝇幼虫的解剖技术及果蝇唾 腺染色体的制片方法 2、观察果蝇的唾腺染色体
二 实验原理
唾腺染色体是一类存在于双翅目昆虫幼虫 唾液腺内的巨大染色体，由于染色体DNA经过 多次复制，但并未发生细胞核分裂，重复复制 后的染色线聚集在一起，因此比一般的染色体 大得多。同时，唾腺细胞中的同源染色体总是 处于配对状态，因此在果蝇唾腺细胞只能看到 体细胞染色体数目的一半。 研究证明，多线染色体的带纹与某些特定 的基因相联系，由于多线染色体上的带纹清晰 可数，因此巨染色体是遗传学上研究染色体形 态结构和染色体畸变的好材料。
三 实验步骤
1、取材(三龄幼虫，5mm)
取一张载玻片放在双筒解剖镜下，滴一滴生理盐水， 将幼虫放在生理盐水内。两手各握一枚解剖针，一 枚钉住幼虫末端的1/3处固定幼虫，另一枚解剖针钉 住幼虫头部，前拉，把头部自身体拉开，可看到唾 腺，剔除唾腺周围的脂肪及其它物质。
2、固定染色 吸去生理盐水，滴数滴盐酸，水解５分钟， 使组织疏松，以便压片时细胞分散，染色体 散开。 吸去盐酸，加1滴蒸馏水轻轻冲洗后吸干， 滴1~2滴醋酸洋红染液，固定染色10~20分 钟。
3、果蝇的转接 被麻醉果蝇移入饲养瓶中，将瓶横卧置放， 否则未醒果蝇粘着于饲料会溺死。待果蝇苏 醒后再将瓶直立，贴上标签，放入培养箱。
３、处女果蝇的选取 雌果蝇受精囊内可贮存大量的精子，因此 在做品系间杂交时，母本必须选用处女蝇。 雌蝇孵出12小时后才会交配（8小时更为可 靠），所以将老果蝇清除后，12小时内所 收集到的雌蝇就是处女蝇。
DNA纯度和浓度鉴定
紫外分光光度计测OD值、琼脂糖凝胶电泳检测。
1 OD260=0.05μg/μl DNA
纯品DNA： OD260/OD280=1.8 >1.8 有RNA <1.8 有蛋白
琼脂糖凝胶电泳，可以看到一条基因组DNA条带。
作业
提取人类口腔脱落细胞基因组DNA。
实验五
PCR法鉴定人SRY基因
果蝇的培养、形态观察及整体装片 的制作
（一）果蝇的生活史
昆虫纲，双翅目。25℃下，~12天完成一个周 期 ：卵→幼虫→蛹→成虫。成体果蝇可活 几周。
卵
幼虫
蛹
成虫
雌雄果蝇的主要 形态特征
性状
体型 腹部末端 背部黑色横纹 腹片数 性梳
雌蝇
较大 腹端尖 7条(可见5条) 6片 无 较小 腹端钝
雄蝇

引物：
dNTP： TapDNA聚合酶： Mg离子溶液： 模板DNA： ddH2O：
各0.5ul
0.5ul 0.5ul 1.5ul 2ul 17ul
PCR实验反应 （35个循环） 94℃ 5min 94℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 30s 72℃ 5min
作业

PCR扩增SRY基因，观察电泳结果是否与性 别相符合。
实验目的
1.认识性别决定基因SRY，了解生物的性 别是由基因决定的。 2.了解PCR方法鉴定基因的原理及步骤。
实验原理
SRY基因在哺乳动物的性别分化过程中起着决 定性的作用，该基因只存在于雄性个体中。以 人为研究对象，对SRY基因进行PCR扩增，若测 试者是男性，样本中存在该基因，测试结果为 阳性；女性测试者则会相应得到阴性结果。
注意安全！
1.穿实验服。 2.各项操作务必规范，小心谨慎。对有
毒有害物质进行操作时，要做好防护。 3.避免在实验室吃喝食物。 4.遵守实验室其他安全守则。
实验报告格式
实验名称
实验人员姓名 学号 实验时间 一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 四、实验结果
实验一
以标注与描述。
实验四 从口腔脱落细胞中提取 人类基因组DNA
实验目的
1、了解从细胞中提取DNA的基本原理
2、学习从口腔脱落细胞中提取高分子量DNA 的基本操作步骤和会影响提取效果的注意事 项。
破坏细胞的细胞膜，释放出 实验原理 DNA。 1.用蛋白酶K（使膜上蛋白 DNA提取的方法： 变 性 分 解 ） 和 去 污 剂 SDS （破坏细胞膜的脂质结构） 浓盐法 共同消化细胞。 阴离子去污剂法 2.然后酚、氯仿等有机溶剂 苯酚抽提法 进行抽提，进行DNA的纯化， 去掉蛋白质、RNA、多糖等 水抽提法 生物大分子。 金属螯合树脂抽提法 3.最后用无水乙醇沉淀DNA， 干燥后用TE溶解，在4℃下 可保存一年。
2、第二周，倒去杂交亲本果蝇。 3、第三周，观察F1眼睛颜色。将F1全部倒 出，轻度麻醉，观察F1成蝇，记载正反交 结果 。观察后，将F1果蝇全部移入一新培 养瓶（这里不需用处女蝇）置25℃温箱中 培养。 4、第四周，倒去F1亲本。 5、第五周，观察F2成蝇眼睛颜色。被统计 过的果蝇处理掉。
四、实验记录及结果分析
（三）果蝇整体装片的制作
１、制片：取轻度麻醉的雌雄果蝇各一只放在 载玻片上，待果蝇将醒能动时，滴一滴树胶 在果蝇上，盖上盖玻片，让盖片自然沉降， 要防止气泡产生。滴树胶的量以浸没果蝇， 盖上盖片不外漏为度。 ２、观察：果蝇的背部横纹、雄果蝇的性梳。
（四）Байду номын сангаас业
制作一张良好的装片，要求能够看到果蝇的背 部横纹及性梳。



蚕豆：实验材料的培养实验处理（用选择的诱变 剂处理2天）根尖细胞恢复培养固定酸解染 色结果观察 用蒸馏水浸洗固定好的幼根两次，每次3-5分钟，吸 净水，加入5mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解510分钟，视幼根软化程度而定，幼根软化即可。 吸去盐酸，用水浸没幼根三次，每次1～2分钟。最 后浸于水中。 制片时，将幼根放置于载玻片上，截下1～2mm左 右长的根尖，滴一滴醋酸洋红染液，染色5～8分钟。 盖上盖玻片，观察。
一般在一个唾腺细胞中能看到5条长臂的染色体，分 别为X染色体、第二对染色体的左臂（L）、右臂 （R）、第三对染色体的左臂（L）、右臂（R）， 这5条染色体臂由染色中心发射出来。这是由于第 四对染色体相当小看不清，Y染色体浓缩，X染色体 的着丝点位于端部只有一条臂之故。
四 作业
制作果蝇巨染色体装片 画出你所观察到的果蝇巨染色体，并加
人SRY基因位于Yp11.3，只含有 一个外显子，没有内含子，转 录单位长约1.1kb，编码一个 204氨基酸的蛋白质。
42
实验步骤
（一）获取口腔脱落细胞，提取DNA （二）PCR扩增SRY基因 （三）电泳检测SRY基因 （SRY基因扩增条带大小约为420bp。）
PCR反应体系（共25ul ）
10X缓冲液： 2.5ul
3.制片 染色完成后，盖上盖玻片压片，然后用吸水 纸包被玻片，吸干多余染色液，并用手指轻压 盖玻片，再用铅笔的橡皮头或解剖针柄垂直轻 敲，或进一步用拇指在盖玻片上适当用力压片， 注意勿使盖玻片移动。 4.观察 将制片置低倍镜下找到分散好的标本，移至 视野中心，然后转到高倍镜下观察。对染色体 分散、个体性清楚的片子，应仔细观察染色体 的横纹数量、形状和排列顺序，以便对照模式 照片辨认出不同的染色体臂。
实验二 果蝇的伴性遗传实验
一、实验目的
了解伴性遗传和非伴性遗传的区别，了解伴 性遗传基因在正、反杂交中的差异。 掌握基本的遗传结果记录及统计处理方法。

二、实验原理
三、实验步骤
1、杂交组合亲本设计
正交：红眼雌蝇(处女蝇)×白眼雄蝇 反交：白眼雌蝇(处女蝇)×红眼雄蝇
反交方法： (a)把红眼果蝇倒出麻醉，仔细挑出４只雄蝇，移到 上述杂交瓶中，贴好标签。 (b) 把白眼雌蝇（处女蝇）倒出麻醉，挑４只移到杂 交瓶中。 (c)等杂交亲本在杂交瓶中全部苏醒后，将杂交瓶移 入25℃温箱中培养。
实验六 微核检测技术
（自主创新实验）
一、实验目的
1. 了解微核检测技术原理和毒理遗传 学意义。 2.培养实验设计能力及解决各类问题 的能力。
二、实验原理
微核（micronucleus， 简称MCN）
也称卫星核，是细胞在分裂时因各种有害因素如辐 射、化学药剂的所带来的损伤，使细胞核成份残留 在核外的微小核染色质块，类似细胞核，游离于主 核之外，呈圆形或椭圆形，但体积较小，大小应在 主核1/3以下。一般认为 ，微核由染色体断片和滞 留染色体组成。这些断片或染色体在分裂过程中行 动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核 之外的核块。当细胞周期进入到下一次分裂间期时， 它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。
图1. 蚕豆根尖细胞微核观察图（上方两图为染色体断裂片段，下方两图为微核）
泥鳅血红细胞微核检测
泥鳅：实验材料的培养实验处理（用选择 的诱变剂处理2天）制片染色结果观察。 用剪刀或刀片断尾取泥鳅外周血于载玻片上， 用一洁净的载玻片迅速从一端向另一端刮去。 晾干后先用瑞氏染液染1min，然后用水洗去 瑞氏染液，再用磷酸缓冲液稀释10倍后的姬 母萨染液染 15 min ，水洗，晾干即可用显 微镜观察。
通过微核检测技术，可同时检测染色体 断裂、丢失、分裂延迟、分裂不平衡、 基因扩增、不分离、DNA损伤修复障碍、 HPRT基因突变、凋亡、细胞分裂不平衡 等多种遗传学终点，可以用来评估某种 环境因素是否具有诱变性。
三、实验步骤
蚕豆根尖微核检测
泥鳅血红细胞微核检测
蚕豆根尖微核检测
蚕豆:根尖细胞的染色体大，DNA含量高，对诱 变因反应敏感，便于观察。